التصوير المتزامن لديناميكيات الخلايا الدبقية الدقيقة والنشاط العصبي في فأر مستيقظ

ابدأ بفأر معدل وراثيا مثبت في إطار تجسيمي ، مع نافذة قمجمة مزروعة فوق قشرته البصرية.

يعبر الفأر عن EGFP في الخلايا الدبقية الصغيرة و R-CaMP ، وهو مؤشر كالسيوم فلوري أحمر ، في الخلايا العصبية للقشرة البصرية.

ضع الماوس تحت مجهر ثنائي الفوتون واضبط العدسة الموضوعية للتركيز على سطح الدماغ.

حرك الماوس بالإطار التجسيمي من العدسة الموضوعية وقم بتوصيل جهاز تظليل.

املأ جهاز التظليل بالماء وأعد وضع الماوس تحت المجهر.

قم بتغطية العدسة بورق أسود.

يحجب جهاز التظليل والرقائق تداخل الضوء الخارجي ، مما يضمن تصويرا دقيقا.

ضع شاشة LCD أمام عين الماوس لتوفير التحفيز البصري.

اضبط معلمات التصوير وابدأ التصوير.

يؤدي

التحفيز البصري إلى إثارة الخلايا العصبية ، مما يؤدي إلى تدفق الكالسيوم وزيادة مضان R-CaMP.

وفي الوقت نفسه ، تسحب الخلايا الدبقية الصغيرة عملياتها أثناء التفاعل مع الخلايا العصبية المنشطة ، كما لوحظ من خلال التصوير الحي.

لتثبيت جهاز التظليل المخصص ، وشاشة LCD للتحفيز البصري ، أولا ، ضع العدسة للتركيز على سطح الدماغ. ثم اضبط موضع العدسة هذا على أنه موضع z الأصلي. حافظ على ثبات إحداثيات x و y ورفع العدسة الموضوعية. قم بإزالة الماوس والأداة التجسيمية من العدسة الموضوعية. قم بتوصيل جهاز تظليل في الجزء العلوي من لوحة الرأس باستخدام السيليكون ، مما يضمن إغلاق المسافة بين لوحة الرأس وجهاز التظليل جيدا.

املأ جهاز التظليل بالماء المقطر. ثم قم بإصلاح الماوس باستخدام الإطار التجسيمي أسفل العدسة الموضوعية. أعد ضبط المستوى البؤري بعناية على سطح الدماغ، وتحقق من عمق العدسة الشيئية. قم بتغطية العدسة الموضوعية بورق الألمنيوم الأسود لتجنب تلوث الضوء من شاشة LCD. اضبط شاشة LCD مقاس 10 بوصات على 12.5 سم أمام عيني الماوس لتقديم المحفزات البصرية.

قم بتكوين مرشحات جمع انبعاث التألق ل EGFP و RCaMP ، والطول الموجي للإثارة إلى 1,000 نانومتر. احصل على صور بدقة مكانية تبلغ 0.25 ميكرون لكل بكسل. ابحث عن منطقة التصوير حيث يمكن تصوير الخلايا العصبية الإيجابية ل RCaMP والخلايا الدبقية الصغيرة الموجبة ل EGFP في وقت واحد في الطبقة 2/3.

احصل على صور بمعدل إطارات 30 هرتز. في الوقت نفسه ، مع الحصول على الصورة ، قم بتقديم محفزات بصرية صريفية منجرفة إلى الماوس في 12 اتجاها في 6 اتجاهات من 0 إلى 150 درجة في خطوات 30 درجة.