القياس الكمي للخلايا العصبية المتولدة حديثا في أنسجة دماغ الفئران باستخدام تقنية التجزئة البصرية

خذ شرائح دماغ الحصين من فأر محقون ببرومودوكسيوريدين، أو BrdU، وهو نظير نيوكليوزيد للثايميدين.

يتكامل BrdU في الحمض النووي أثناء انقسام الخلية ، ويضع علامات على الخلايا العصبية المتولدة حديثا داخل التلفيف المسنن ، وهي منطقة لتكوين الخلايا العصبية.

احتضان بعامل مؤكسد لتعطيل إنزيمات البيروكسيديز الذاتية.

عالج بالحمض لتشويه الحمض النووي وفضح BrdU ، ثم قم بتحييد الحمض.

احتضان بمنظف لاختراق الأغشية الخلوية ومحلول مانع لإخفاء مواقع الربط غير المحددة.

احتضان بالأجسام المضادة الأولية التي تستهدف BrdU ، متبوعة بالأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالبيروكسيداز الخاصة بالأجسام المضادة الأولية.

أدخل ركيزة كروموجينيك وعامل مؤكسد ، مما يسمح للبيروكسيداز بتحويل الركيزة إلى بقايا ملونة.

قم بتركيب الأنسجة وقم بصبغة ربط الحمض النووي.

جفف الأنسجة ثم عالجها لزيادة الشفافية.

تحت المجهر ، حدد التلفيف المسنن.

باستخدام تقنية التجزئة البصرية ، قم بتحليل مستويات متعددة عبر سمك الأنسجة لتحديد الخلايا العصبية المسماة BrdU.

عندما تكون جاهزا للبدء ، تلطيخ مناعي ، اسمح للأقسام بالصعود إلى درجة حرارة الغرفة. ثم استخدم فرشاة الرسم لنقل كل قسم خامس من سلسلة من أقسام الحصين إلى شبكات تلطيخ 25 بئرا موضوعة في أطباق بتري مليئة ب PBS. يجب أن يكون هناك 8 إلى 12 قسما لكل حصين للتلطيخ. انقل شبكات التلوين ، التي تحتوي على الأقسام ، إلى أطباق زجاجية مطابقة ، تحتوي على PBS ، واغسل الأقسام مرتين لمدة 10 دقائق في PBS.

ثم احتضن بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ لمدة 20 دقيقة. بعد الغسيل ، حرك الأقسام من خلال ثلاثة محاليل حمض الهيدروكلوريك. ثم قم بتحييد 0.1 مولار رباعي الصوديوم في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

بعد ثلاث حضانات لمدة 10 دقائق في تغييرات عازلة الغسيل ، انقل الأقسام إلى محلول مانع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم باحتضان الأقسام في الفأر المضاد ل BrdU ، المخفف من 1 إلى 100 في محلول مانع لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.

بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، اغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في مخزن الغسيل ، ثم احتضنه لمدة 48 ساعة في بيروكسيداز الفجل الحار ، المخفف من 1 إلى 10 في محلول الغسيل. بعد 48 ساعة ، انقل الأقسام إلى PBS لمدة 10 دقائق ، وكرر ذلك لمدة خمس غسلات. بعد الغسيل ، انقل الأقسام إلى محلول DAB لمدة سبع دقائق. ثم انقله إلى محلول DAB الذي يحتوي على بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 0.02٪ لمدة 10 دقائق.

بعد سلسلة من الغسلات ، قم بتركيب الأقسام بترتيب رقمي على شرائح المجهر. اتركيه ليجف لمدة 30 دقيقة تقريبا. بعد ذلك ، جفف العينات بالهواء عن طريق وضعها في رف منزلق. بعد ذلك ، أعد ترطيب العينات لمدة 10 دقائق في طبق تلطيخ منزلق يحتوي على الماء المقطر.

ثم انقل الشرائح إلى 0.02٪ بنفسجي بلوري في ماء مقطر لمدة 15 دقيقة. بعد تكرار صبغة البنفسج البلورية ، أعد ترطيب الأقسام من خلال سلسلة الإيثانول. ثم امسح الأقسام في الزيلين مرتين لمدة 15 دقيقة في كل مرة. أخيرا ، أضف وسط تركيب التجفيف السريع ، وقم بتغطية الشرائح.

بعد 24 ساعة ، يمكن استخدام الشرائح للفحص المجهري. ابدأ بفحص سمك الأنسجة عن طريق وضع الشرائح أولا على المرحلة الآلية من المجهر ، ثم فتح برنامج الاسترولوجيا. حدد منطقة الاهتمام باستخدام هدف تكبير منخفض قبل التغيير إلى هدف غمر الزيت بمقدار 100 ضعف.

بعد ذلك ، اختر نقطة معينة في إطار المحاسبة ، على سبيل المثال ، منطقة مجاورة للزاوية ، وحدد الجزء العلوي من القسم عن طريق التحرك على طول المستوى البؤري حتى تظهر بعض ميزات القسم في التركيز. سجل هذا الموضع z ك 0. بعد ذلك ، حرك المستوى البؤري لأسفل عبر الأنسجة حتى يصبح المستوى z الأخير من الأنسجة في بؤرة التركيز ، ثم حدد هذا الموضع. يتم تحديد سمك الأنسجة المحلية من 0 إلى نقطة النهاية هذه ، ويمكن قراءتها على المحور z.

سجل سمك الأنسجة. يتم قياس سمك الأنسجة في عدة أماكن داخل منطقة الاهتمام. يتم تحديد ارتفاع التشريح ومناطق الحراسة ، وحجم العد ، وطول الخطوة ، والتكبير النهائي في دراسة تجريبية. الآن ، يمكنك البدء في حساب الخلايا العصبية الإيجابية ل BrdU ، عادة بتكبير نهائي من 2,000 إلى 3,000x ، باستخدام زيت 60x ، أو هدف زيت 100x ، وفتحة عددية عالية.

حدد الخلايا العصبية الإيجابية BrdU في كل إطار عد ، ولكن لا تحسب تلك التي تلامس خط الاستبعاد الأحمر. احسب تلك الخلايا العصبية الإيجابية ل BrdU التي تلامس خط التضمين الأخضر ، وتلك التي تقع ضمن حدود إطار العد. عد الخلايا العصبية الإيجابية ل BrdU فقط عندما يتم التعرف على ميزة الاهتمام بوضوح داخل ارتفاع التشريح. لا يتم احتساب الخلايا العصبية شبه المرئية الموضحة هنا.