تصور تدفق الكالسيوم في الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط البطني المشتقة من أجنة الفئران

خذ غطاء مع ثقافة الخلايا العصبية البطنية في الدماغ المتوسط المشتقة من أجنة الفئران.

تصاب الخلايا بناقل فيروسي للتعبير عن مؤشر الكالسيوم.

انقل قسيمة الغطاء إلى غرفة التسجيل الخاصة بمجهر متحد البؤر مليء بمخزن مؤقت للتسجيل.

باستخدام الضوء المرئي ، حدد منطقة تحتوي على خلايا عصبية متعددة ، ثم انتقل إلى التصوير الفلوري.

عند مستويات الكالسيوم المنخفضة داخل الخلايا ، يظل المؤشر غير مرتبط ، مما يظهر كثافة مضان منخفضة.

تولد الخصائص الجوهرية للخلايا العصبية إمكانات عمل تلقائية ، مما يؤدي إلى فتح قنوات الكالسيوم ذات الجهد الكهربائي والسماح بتدفق الكالسيوم.

يرتبط الكالسيوم الزائد بالمؤشر ، مما يؤدي إلى تغيير توافقي يزيد من شدة التألق.

سجل شدة التألق بمرور الوقت لتتبع نشاط الكالسيوم التلقائي.

أدخل ناقلا عصبيا بتركيز عال ، والذي يرتبط بالمستقبلات الموجودة على الخلايا العصبية ، مما يولد إمكانات عمل مستمرة.

يؤدي تنشيط قناة الكالسيوم المستمر بالجهد الكهربائي إلى إطالة تدفق الكالسيوم ، مما يتسبب في زيادة مستمرة في شدة التألق.

قم بإعداد 1 لتر من المخزن المؤقت لتسجيل HEPES ، و 200 مل من 20 مخزن مؤقت لتسجيل الغلوتامات الدقيقة ، و 200 مل من 10 ميكرومولار للتسجيل NBQX وفقا لتوجيهات المخطوطة. املأ طبق بتري معقم بحجم ملليمتر ب 3 ملليلتر من المخزن المؤقت للتسجيل.

خذ طبق بتري مع الثقافات المصابة من الحاضنة ، ثم أمسك بعناية حافة غطاء واحد باستخدام ملقط طرف ناعم ، وانقله إلى الطبق باستخدام المخزن المؤقت للتسجيل. ضع الغطاء المتبقي في وسط مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية ، وانقل الطبق مع مخزن التسجيل إلى المجهر متحد البؤر.

ابدأ تشغيل برنامج التصوير. أثناء التهيئة، ابدأ تشغيل المضخة التمعجية وضع الخط في المخزن المؤقت للتسجيل. ثم معايرة التدفق إلى 2 ملليلتر في الدقيقة. انقل الغطاء المصاب من طبق بتري إلى حمام التسجيل باستخدام ملقط ناعم. باستخدام هدف الغمر في الماء 10x وضوء المجال الساطع ، ابحث عن مستوى التركيز ، وابحث عن منطقة ذات كثافة عالية من أجسام الخلايا العصبية. ثم قم بالتبديل إلى هدف 40X وأعد تركيز العينة.

حدد وقم بتطبيق Alexa Flour 488 في نافذة قائمة الأصباغ. من أجل منع التعرض المفرط والتبييض الضوئي للفلوروفورات ، ابدأ بإعدادات منخفضة الجهد العالي وطاقة الليزر. بالنسبة لقناة Alexa Fluor 488 ، اضبط HV على 500 ، والكسب على 1x ، والإزاحة على الصفر. اضبط الطاقة على 5٪ لخط الليزر 488 ، وقم بزيادة حجم الثقب إلى 300 ميكرومتر ، واستخدم خيار مسح التركيز × 2 لضبط إشارات الانبعاث على النحو الأمثل على مستويات التشبع الفرعي.

يمكن بعد ذلك ضبط الإعدادات للحصول على الرؤية المثلى لكل قناة. بمجرد تحسين إعدادات المجهر ، حرك المسرح لتحديد موقع منطقة بها خلايا متعددة تعرض تغييرات تلقائية في مضان GCaMP6f ، وركز على المستوى المطلوب للتصوير. استخدم أداة clip rect لقص إطار التصوير إلى حجم يمكن أن يحقق فاصل زمني للإطار أقل بقليل من ثانية واحدة. قم بتعيين نافذة الفاصل الزمني إلى قيمة 1.0 ونافذة Num إلى 600.

لالتقاط فيلم من السلسلة T، حدد خيار الوقت، ثم استخدم خيار المسح الضوئي XYt لبدء التصوير. شاهد شريط تقدم التصوير ، وحرك الخط من المخزن المؤقت لتسجيل HEPES إلى المخزن المؤقت لتسجيل الغلوتامات 20 ميكرومولار في النقطة الزمنية المناسبة. عند اكتمال التصوير، حدد زر انتهاء السلسلة، واحفظ فيلم السلسلة t النهائي. استمر في تقويض الغلوتامات لمدة خمس دقائق إضافية ، بحيث تعرضت الخلايا العصبية المستنبتة للغلوتامات لمدة 10 دقائق.

كرر هذه العملية لكل قسيمة غلاف ليتم تصويرها. من الممكن عرض آثار الكالسيوم في أجسام الخلايا العصبية مباشرة بعد التجربة. استخدم أداة القطع الناقص لرسم العدد المطلوب من عائد الاستثمار حول السوما العصبي ، واستخدم زر تحليل السلسلة لتصور الآثار. بعد التعرض الإضافي لمدة خمس دقائق للغلوتامات ، قم بإزالة الغطاء من الحمام باستخدام ملقط ناعم ، ثم ضعه مرة أخرى في طبق بتري مع المخزن المؤقت للتسجيل حتى يكتمل التصوير بالكامل.