تصوير الكالسيوم في المختبر في مزارع الحصين قصيرة وطويلة المدى للفئران

خذ ثقافة عصبية الحصين قصيرة المدى للفئران تمثل الخلايا العصبية الشابة وثقافة طويلة المدى تمثل الخلايا العصبية المسنة.

تظهر الخلايا العصبية القديمة كثافة أعلى من قنوات الكالسيوم ذات الجهد المضغوط من النوع L ، أو L-VGCCs ، والتي تظل مفتوحة لفترة أطول عند إزالة الاستقطاب الغشائي

احتضن بمؤشر الكالسيوم الفلوري الذي ينتشر في الخلايا ، ثم اغسله لإزالة أي صبغة زائدة.

ضع الثقافات في غرفة التروية تحت المجهر الفلوري.

أدخل محلولا يحتوي على ناقلات عصبية ترتبط بالمستقبلات الموجودة على الخلايا العصبية ، مما يؤدي إلى تدفق أيونات الصوديوم ويؤدي إلى إزالة الاستقطاب الغشائية.

تعمل

إزالة الاستقطاب على تنشيط L-VGCCs ، مما يتيح تدفق الكالسيوم إلى السيتوبلازم.

في الثقافة طويلة المدى ، تؤدي الكثافة العالية والفتح المطول ل L-VGCCs إلى زيادة الكالسيوم ، وهي سمة مميزة لشيخوخة الخلايا العصبية.

يولد ارتباط الكالسيوم بالمؤشر التألق ، حيث تظهر الخلايا العصبية القديمة كثافة مضان أعلى ، مما يعكس زيادة مستويات الكالسيوم داخل الخلايا عند التحفيز.

في هذا الإجراء ، احتضان الخلايا باستخدام Fura2-AM لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، ثم انقل الغطاء إلى غرفة التروية. بعد ذلك ، ضع غرفة التروية مع الغطاء في الحامل على المجهر المقلوب. حدد المجال المجهري وقم ببث الخلايا باستمرار باستخدام HBS الدافئ مسبقا.

بعد ذلك ، قم بإضاءة الخلايا عند 340 و 380 نانومتر في النهاية ، ثم سجل الضوء المنبعث من 520 نانومتر كل 5 إلى 10 ثوان باستخدام كاميرا مضان ، والتي يتم ترشيحها بواسطة مرآة Fura-2 ثنائية اللون. لتحليل صور الفلورسنت المسجلة. أولا، افتح ملف التجربة.

باستخدام برنامج AquaCosmos ، انقر فوق النسبة وحدد نطاق النسبة المطلوب. احسب نسبة البكسل بالبكسل في الصور الناتجة من أجل الحصول على سلسلة من الصور النسبة. ثم اطرح الخلفية عن طريق ضبط زر إضاءة الخلفية. بعد ذلك ، اضغط على بدء الحساب. بعد ذلك ، اضغط على زر تسلسل كل الوقت وامسح عائد الاستثمار القديم.

للتحليل الكمي للخلايا الفردية ، قم بإنشاء عائد استثمار جديد أو عائد استثمار يتوافق مع الخلايا العصبية الفردية. لرسم التسجيلات الفردية ، قم بتصدير قيم النسبة الفلورية المقابلة لكل عائد استثمار إلى برنامج المختبر الأصلي بالنقر فوق رسم بياني. ثم انقر فوق حساب وحفظ ملف TXT. بعد ذلك ، قم بإجراء الحساب المقابل لتقدير حجم الارتفاع في نسبة التألق استجابة لكل تحفيز.