تصور ثلاثي الأبعاد لعدوى فيروس داء في أنسجة دماغ الفئران

خذ قسما سميكا ثابتا من فأر مصاب بفيروس داء.

يصيب الفيروس الخلايا العصبية ويتكاثر ، مما ينتج عنه بروتينات فيروسية موجودة داخل الخلايا.

عالج بمنظف لاختراق الأغشية الخلوية ومحلول مانع لإخفاء مواقع الربط غير المحددة.

احتضان الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف البروتينات الفيروسية ، تليها الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور التي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية.

عالج بصبغة ملزمة بالحمض النووي الفلوري لتسمية النواة.

قم بتجفيف الأنسجة في زيادة تركيزات الكحول ، ثم ضع محلول مقاصة لزيادة شفافية الأنسجة للتصوير.

قم بتركيب القسم في غرفة التصوير ، واملأه بمحلول المقاصة ، وأغلقه.

باستخدام الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر ، قم بتصوير الأنسجة بشكل منفصل باستخدام ملصقات الفلورسنت ، ثم دمجها لإنشاء صورة ثنائية الأبعاد.

احصل على صور في مستويات بؤرية مختلفة عبر الأنسجة ودمجها لإنشاء تمثيل ثلاثي الأبعاد لتقييم تطور العدوى.

للتلوين المناعي لأقسام أنسجة المخ ، اغسل العينات مرتين لمدة ساعة واحدة في 4 ملليلتر من 0.2٪ Triton X-100 في PBS ، متبوعا بالنفاذية لمدة يومين عند 37 درجة مئوية ، في 4 ملليلتر من 0.2٪ Triton X-100 ، 20٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، و 0.3 مولي جلايسين في PBS. منع أي ارتباط غير محدد ب 4 ملليلتر من 0.2٪ Triton X-100 و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 6٪ مصل طبيعي في PBS لمدة يومين عند 37 درجة مئوية.

في نهاية حضانة الحجب ، قم بتسمية العينات ب 2 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية لمدة خمسة أيام عند 37 درجة مئوية ، مع تحديث محلول الجسم المضاد بعد يومين ونصف. بعد ذلك ، اغسل العينات ليوم واحد في 4 ملليلتر من 0.2٪ توين 20 و 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الهيبارين في PBS ، وتبادل المخزن المؤقت للغسيل أربع إلى خمس مرات على الأقل خلال اليوم وترك الغسيل النهائي طوال الليل.

في اليوم التالي ، احتضان العينات في 2 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة خمسة أيام عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، اغسل العينات في 4 ملليلتر من 0.2٪ توين 20 و 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الهيبارين في PBS كما هو موضح.

للتلوين النووي للعينات ، احتضان العينات في 4 ملليلتر من صبغة الحمض النووي TO-PRO-3 لمدة 5 ساعات ، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة ، اغسل العينات في 0.2٪ توين 20 و 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الهيبارين في PBS كما هو موضح ، متبوعا بالجفاف في سلسلة تصاعدية من ثلاثي البيوتانول لمدة ساعتين لكل غمر.

بعد الغمر بنسبة 90٪ ، انقل العينات إلى محلول ثلاثي البيوتانول بنسبة 96٪ طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، قم بتجفيف العينات بشكل أكبر في 100٪ من ثلاثي البيوتانول لمدة ساعتين قبل تنظيف أقسام الأنسجة في BABB-D15 المحضر حديثا لمدة 2 إلى 6 ساعات حتى تصبح شفافة بصريا. يمكن بعد ذلك تخزين العينات في BABB-D15 ، محمية من الضوء حتى تركيبها وتصويرها.

لتركيب العينة، استخدم طابعة ثلاثية الأبعاد لطباعة غرفة التصوير والغطاء. قم بتركيب غطاء بقطر 30 ملم على غرفة التصوير باستخدام مكون واحد من مطاط السيليكون بالكبريت بدرجة حرارة الغرفة. وبالمثل ، قم بتركيب غطاء 22 ملم على الغطاء. استخدم قطعة قطن مبللة بالماء لإزالة مطاط السيليكون الزائد على كلتا الحلقتين قبل السماح للمطاط بالشفاء طوال الليل.

في اليوم التالي ، ضع عينة في غرفة التصوير وأضف كمية صغيرة من BABB-D15 إلى الغرفة قبل إدخال الغطاء. باستخدام إبرة تحت الجلد ، املأ الغرفة ب BABB-D15 من خلال المدخل وقم بتوصيل المدخل قبل إغلاق غرفة التصوير بمطاط السيليكون.

لإعداد الحصول على الصورة ، حدد خطوط الليزر المناسبة للفلوروفورات المستخدمة واضبط نطاقات الكشف لكل كاشف لمنع تداخل الإشارة بين القنوات. ثم قم بتعيين معلمات الاكتساب ، وحدد الحد العلوي والسفلي للمكدس ، واحصل على مكدس الصور.

لإنشاء إسقاطات ثلاثية الأبعاد لمكدس الصور ، افتح ملفات الصور في فيجي وحدد الصورة واللون وأداة القنوات والمزيد وتقسيم القنوات لتقسيم الصور المدمجة إلى قنوات فردية. لتصحيح التبييض للصور لكل قناة، حدد Image وAdjust وBleach Correction وحدد Simple ratio. استخدم أشرطة التمرير لضبط السطوع والتباين لكل قناة وحدد الصورة واللون ودمج القنوات. ضع علامة في الخيار إنشاء مركب.

قم بتحويل الصورة إلى تنسيق RGB وحدد Image و Stacks و 3D project لإنشاء عرض ثلاثي الأبعاد. حدد النقطة الأكثر سطوعا كطريقة الإسقاط واضبط تباعد الشرائح لمطابقة حجم الخطوة Z لمكدس الصور المكتسبة. للحصول على أقصى جودة، اضبط زيادة زاوية الدوران على 1 وقم بتمكين الاستيفاء. قم بتعديل إجمالي التدوير وعتبات الشفافية والتعتيم حسب الحاجة. ثم احفظ الإسقاط ثلاثي الأبعاد كحد سواء. تنسيقات ملفات TIFF و .AVI.