استخدام قياس الانعكاس الطيفي لتحديد أقطار المحور العصبي النخاعي في شريحة دماغ الفأر الثابتة

خذ مجهر متحد البؤر فائق الطيف مع مصدر ليزر مستقر تم تكوينه لنطاق طيفي واسع لفك تشفير البنية النانوية لغمد المايلين لأنسجة المخ.

استخدم مرآة مرجعية لالتقاط طيف الانعكاس الأساسي. قم بإزالة المرآة واحصل على طيف إزاحة داكن لتصحيح ضوضاء الكاشف.

انقل غرفة بها قسم ثابت من أنسجة المخ إلى مرحلة المجهر.

قم بمحاذاة المستوى البؤري مع منطقة الأنسجة محل الاهتمام ، مما يضمن العمق الكافي لتقليل التداخل من واجهة الأنسجة الزجاجية.

يتم توجيه ضوء الليزر إلى غمد المايلين متعدد الطبقات من المحاور.

عندما يتفاعل الضوء مع المايلين ، تحدث انعكاسات جزئية في واجهات الطبقات ، مما ينتج عنه أنماط تداخل بسبب سماكة الطبقة المتفاوتة ومؤشرات الانكسار.

الحصول على صور طيفية لمخططات التداخل هذه.

بعد تصحيح خط الأساس وتحليل الإشارة ، يكشف طيف الانعكاس عن دورية الرقم الموجي ، مما يسمح بتحديد أقطار المحور العصبي النخاعي.

قم بتركيب مرآة مرجعية على مرحلة المجهر ، بحيث يكون السطح مواجها للعدسة الموضوعية. إذا لم يكن من السهل وضع المرآة على مرحلة المجهر ، فقم بلصق مرآة على اللوحة المسطحة. اضبط مرحلة المجهر لمحاذاة المستوى البؤري مع سطح المرآة. بعد ذلك ، اضبط كسب PMT وقوة الليزر ، مع مراعاة النطاق الديناميكي للكاشف.

تحت لون زائف ، تحقق من عدم وجود تشبع في جميع أنحاء نطاق الطول الموجي. إذا لوحظ التشبع ، فقم بخفض طاقة الليزر. ثم قم بتشغيل عملية الاستحواذ على مسح lambda. قم بإزالة المرآة من المسرح ، وكرر نفس الاستحواذ بدون عينة من أجل الحصول على المرجع المظلم. بعد ذلك ، احفظ البيانات بتنسيق TIFF متعدد المكدسات.

لإجراء الحصول على صورة SpeRe ، ضع الأنسجة المثبتة على مرحلة المجهر. لمحاذاة الأنسجة تقريبا مع المستوى البؤري للعدسة الشيئية ، من خلال عدسة ، استخدم وضع التألق واسع المجال. مع تشغيل الفحص المباشر ، تحكم في مرحلة المجهر لمحاذاة المستوى البؤري مع منطقة الاهتمام في الأنسجة. لتجنب ضوضاء الخلفية من الغطاء ، حدد منطقة مستهدفة بعمق 15 ميكرومتر على الأقل من واجهة الأنسجة الزجاجية.

احصل على مكدس الصور الطيفية للمنطقة المستهدفة باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. بعد ذلك ، احفظ البيانات الخاصة بالأنسجة والإزاحة الداكنة بتنسيق TIFF متعدد التكدس. لمعالجة الصور في ImageJ، افتح البيانات الطيفية للمرآة المرجعية وأنسجة الدماغ.

حدد عائد الاستثمار لمكدسات الصور المفتوحة ، والمنطقة المركزية للمرآة المرجعية ، وجزء من ألياف محورية لأنسجة الدماغ. بعد ذلك ، قم بتشغيل الصورة ، والمكدسات ، ومخططات ملف تعريف المحور z للحصول على الأطياف الأولية لعائد الاستثمار المحدد.

قد تكون ألياف المحور العصبي غير متجانسة هيكليا على طول أطوالها ، وبالتالي يوصى باختيار عائد الاستثمار على جزء محوري صغير ، عادة أقل من 5 ميكرومتر ، لتقليل القطع الأثرية ذات الحجم الجزئي.

افتح بيانات الإزاحة المظلمة ، أحدها مأخوذ للمرآة المرجعية ، والآخر مأخوذ لأنسجة المخ ، وارسم ملف تعريف المحور z كما هو موضح للتو. بعد ذلك ، استخدم خيارات النسخ واللصق لحفظ جميع الخيارات المكتسبة.