تصور إسقاطات الخلايا العصبية الحركية وتفرع المحاور العصبي باستخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الخفيفة

خذ جزءا من الأنسجة الثابتة والمقاصة كيميائيا من جنين فأر معدل وراثيا يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في الخلايا العصبية الحركية للعمود الفقري.

قم بتركيب الأنسجة عموديا على طرف ماصة معدل.

قم بتوصيل الطرف بالشعيرات الدموية المثبتة داخل مجهر مضان الورقة الخفيفة.

ضع حجرة عينة مملوءة بالعازلة أسفل الأنسجة لغمرها وإزالة الحطام.

باستخدام برنامج التصوير، قم بمحاذاة الأنسجة في مسار الضوء.

ابدأ الحصول على الصورة.

ينبعث مصدر الضوء من ورقة رقيقة من ضوء الليزر ، ومثير GFPs في مستوى واحد من الأنسجة لإصدار تألق.

يلتقط الكاشف الموجود بشكل عمودي على مسار الضوء التألق المنبعث.

الحصول على صور للخلايا العصبية الحركية الشوكية لتوليد إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لمورفولوجيا التفرع المحوري.

استخدم البرنامج لتعيين المحاور العصبية وتحديد الأنماط المتفرعة ونقاط النهاية لتقييم نمو الخلايا العصبية الحركية والاتصال.

قم بإعداد بصريات الإضاءة 5X / 0.1 وبصريات الكشف 5X / 0.16. قم بتجميع حامل العينة والعينة الشعرية. تحضير غرفة العينة عن طريق ملئها بمحلول المقاصة. لتركيب الجنين، قم بإعداد طرف ماصة P200 عن طريق قطع الجزء العلوي بحيث يناسب قطر الشعيرات الدموية، وقم بإزالة الجزء المدبب لمرفق العينة.

ثم قم بإذابة الطرف الضعيف لطرف الماصة باستخدام لهب صغير. أطفئ اللهب وقم بإرفاق الجنين بسرعة عموديا على الطرف الذائب. قم بتركيب الجزء العلوي من طرف الماصة مع العينة الشعرية، وضع حجرة العينة المعدة في المجهر. باستخدام برنامج التصوير، حدد تحديد موقع الشعيرات الدموية ضمن علامة التبويب تحديد الموقع، واضبط المحورين xy وz.

بعد ذلك ، حدد تحديد موقع العينة والتكبير إلى 0.6X للتركيز على الجنين. اسمح للمخزن المؤقت للغرفة بالتوازن مع الجنين لبعض الوقت لإزالة أي حطام أو فقاعات. للحصول على الصور ضمن علامة التبويب الاكتساب، حدد معلمات مسار الضوء، مثل أهداف الكشف ومرشح حجب الليزر وفاصل الشعاع والكاميرات والليزر.

حدد خانة الاختيار المسح المحوري لتقليل الظل. ثم حدد إعدادات الاستحواذ ، عمق البت إلى 16 بت. قم بالتكبير إلى النطاق بين 0.36 و 0.7X إضاءة أحادية الجانب أو إضاءة مزدوجة الجانب. انقر فوق مستمر، واضبط شدة الليزر ووقت التعرض وطاقة الليزر وموضع ورقة الضوء. بعد ذلك ، اضغط على إيقاف لإنهاء الحصول على الصورة.

من المهم التأكد من وضع العينة الشفافة داخل أقصر مسار ضوئي للسماح بالحصول على صور مفصلة للهياكل المستقيمة الدقيقة على الأعصاب الحركية الفردية.

للاكتساب متعدد الأبعاد، حدد مكدس Z عن طريق تحريك موضع Z للصورة الأولى والأخيرة. انقر فوق Optimal لتعيين رقم الشريحة. ثم انقر فوق بدء التجربة للحصول على مكدس Z المحدد. عند الانتهاء ، احفظ الصورة بتنسيق نقطة CZI.

لتحديد كمية تشجير المحاور العصبي ، افتح ملف الصورة في برنامج تحليل التصوير. اضبط لون الصورة وسطوعها وتباينها باستخدام نافذة ضبط الشاشة لاكتشاف الخيوط بناء على تباين الشدة المحلية. بعد ذلك ، انقر فوق أيقونة إضافة خيوط جديدة ، وحدد خوارزمية المسار التلقائي في القائمة المنسدلة. حدد منطقة الاهتمام.

بعد ذلك ، حدد نقاط البداية والبذور عن طريق تعيين أكبر وأنحف قياسات القطر ، والتي يمكن قياسها باستخدام وضع الشريحة. قم بتعيين نقطة بداية على حافة منطقة الاهتمام. لتحقيق الإضافة أو الإزالة اليدوية لنقاط البداية، أولا، قم بتغيير وضع المؤشر، وانتقل إلى تحديد، ثم قم بالإزاحة والنقر بزر الماوس الأيمن عند نقاط الاهتمام.

بعد ذلك، حدد العتبات اليدوية للنقاط الأولية للتأكد من وضع علامة على كل الأشجار المرئية. بعد ذلك، قم بإضافة نقاط البذور أو إزالتها يدويا. حدد المربع ، إزالة المقاطع غير المتصلة ، وقم بإزالة النقاط الأولية حول نقاط البداية. بعد ذلك ، اضبط عتبة طرح الخلفية وقم بإنهاء العملية.

من الضروري إزالة القطع الأثرية في الخلفية والتأكد من أن مسار الكاشف يعكس التشكيل العصبي الحقيقي من أجل القياس الكمي بدقة.

في النهاية ، اختر النمط واللون المطلوبين. ضمن علامة التبويب الإحصائيات ، حدد مفصلا ، واستخدم النقاط الطرفية للتغصنات لرقم الفتيل لتحديد الأطراف العصبية الحركية كمؤشر على تشجير المحور العصبي الحركي. بعد ذلك ، قم بتصدير صورة المحور العصبي المعاد بناؤه ك . ملف TIFF.