الحفظ بالتبريد من أجنة الفئران التي التزجيج جلايكول الإثيلين ، واستنادا

الهدف العام من هذا الإجراء هو حفظ أجنة الفئران بالتبريد في النيتروجين السائل وإذابتها لاستعادة الفئران الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق غمر أجنة الفأر أولا في وسط التوازن ، ونقلها إلى وسط التزجيج في أنبوب التبريد ، ثم وضعها في خزان النيتروجين السائل. يمكن إذابة الأجنة اللاحقة في وسط تناضحي مرتفع واحتضانها في وسط مزرعة حتى يتم نقلها إلى الإناث المتلقية.

في النهاية ، تظهر النتائج بقاء أكثر من 90٪ من الأجنة على قيد الحياة بعد الذوبان الزجاجي ، ومعدلات المواليد بين 30 إلى 70٪ بعد نقل الأجنة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الجليكول القابل للاختراق بالتبريد أقل سمية للأجنة من مادة الحماج بالتبريد التقليدية. سيتم توضيح الإجراء فني من مختبري قبل بدء هذا البروتوكول.

قم بإعداد جنينتين من الفئران الخلوية في المزرعة التي تم الحصول عليها عن طريق التزاوج الطبيعي أو تقنيات التلقيح الاصطناعي التقليدية إلى أنبوب التبريد للتخزين النهائي ، أضف 50 ميكرولترا من محلول تجميد الأجنة EF S 40. ثم قم بإعداد طبق بتري بلاستيكي 35 ملم أو 60 ملم مع 50 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة. EFS 20.

استخدم شعيرات دموية زجاجية لنقل ما يصل إلى 30 جنينا إلى الطبق. احرص على تجنب نقل وسيط الثقافة. أيضا لضمان جفاف الأجنة ، ضعها في قاع القطرة.

بعد حوالي 60 إلى 90 ثانية ، استخدم أنبوبا شعريا لسحب الأجنة المجففة. مع مورفولوجيا منكمشة. انقل هذه الأجنة إلى محلول EFS في أنبوب التبريد ، وانقل أقل قدر ممكن من EFS 20.

بمجرد نقل الأجنة ، اسمح لها بالاستقرار في EFS 40 لمدة دقيقة واحدة قبل تجميدها في النيتروجين السائل. قبل الذوبان ، ضع الأجنة في طبق استزراع قطرتين على الأقل من وسط زراعة الأجنة بسعة 10 ميكرولتر ، مثل وسط M 16. ثم قم بتغطية القطرات بالكامل بالسيليكون أو الزيت المعدني ، ثم ضع الطبق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون حتى الاستخدام.

بعد ذلك ، قم بتسخين محلول TS إلى 37 درجة مئوية أثناء ارتداء قناع الوجه وقفازات التبريد. استرجع الأجنة من خزان النيتروجين السائل. الآن افتح أنبوب التبريد بسرعة وتخلص من أي نيتروجين سائل في الخزان أو أي حاوية مناسبة.

ثم انتظر 30 ثانية. أضف الآن 850 ميكرولتر من محلول TS الدافئ إلى أنبوب التبريد. امتصاص المحلول برفق وقم بإخراجه حوالي 10 مرات حتى يذوب بالتساوي.

ثم انقل الحجم بالكامل إلى طبق بتري بلاستيكي 60 ملم. أو شاهد الزجاج ينتظر ثلاث دقائق حتى تتوازن الأجنة مع درجة حرارة الغرفة حيث يجب أن تبقى لبقية الإجراء. لا تستخدم جهاز التدفئة.

افحص الأجنة الموجودة في الطبق بسرعة تحت مجهر استريو لمعرفة كيف تبدو في بداية هذه الحضانة. بعد حوالي دقيقتين من الحضانة ، اغرق الأجنة عن طريق رج الطبق برفق حتى ينتشر الوسط على سطح الطبق. في الدقيقة الأخيرة من الحضانة ، قم بإخراج ثلاث قطرات منفصلة سعة 50 ميكرولتر من محلول TS في طبق.

عندما تنتهي الدقائق الثلاث ، استخدم مجهر ستيريو للتأكد من أن الأجنة قد تقلصت قليلا. إذا كانت الأجنة لا تزال منتفخة ، فاستمر في الحضانة لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق أخرى. الآن ، التقط الأجنة بشعرية زجاجية وانقلها إلى أول قطرة من TS اثنين.

انتظر ثلاث دقائق وانقل الأجنة إلى القطرة الثانية. تليها القطرة الثالثة. أخيرا ، استرجع طبق الجنين المتوسط المحضر المخزن في الحاضنة ، واستخدم الشعيرات الدموية الزجاجية لنقل الأجنة إلى أول قطرة من الوسط.

إذا تم فحصها تحت مجسم ، يجب أن تستعيد الأجنة مورفولوجيتها الطبيعية ببطء. الآن ، أعد الطبق إلى الحاضنة لمدة 10 دقائق. ثم لغسل السكروز الذي تم نقله من TS الثاني.

انقل الأجنة إلى القطرة التالية من وسط الاستزراع. استمر في زراعة الأجنة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون حتى يتم نقلها إلى جامعة كاليفورنيا للإناث المتلقية. بعد التزجيج والتعافي بين 300 و 480 جنينا من ثلاث سلالات مختلفة من الفئران ، كانت القدرة على البقاء عالية جدا.

بعد الذوبان ، كان جزء الأجنة الذي يظهر مورفولوجيا طبيعية بين 93 و 99٪ ومن تلك الأجنة تطور 84٪ على الأقل إلى أكياس انفجارية. لا تنس أن العمل مع تسرب النيتروجين يمكن أن يكون خطيرا للغاية واحتياطات لتجنب الاتصال المباشر وتقليل التعرض لمسافات قصيرة للتسرب. يجب دائما تناول النيتروجين عن طريق تنفيذ هذا الإجراء.