التصوير الكيميائي النسيجي للوحدات القشرية في أقسام الدماغ المسطحة

ابدأ بالأقسام العرضية الثابتة مسبقا للأقسام القشرية للدماغ المسطحة. يغسل لإزالة آثار التثبيت.

قم بتلطيخ الأقسام بمحلول ديامينوبنزيدين أو DAB وكبريتات النيكل والأمونيوم.

ينتشر DAB في الخلايا العصبية القشرية ويتفاعل مع السيتوكروم أوكسيديز في الميتوكوندريا ، مكونا راسب داكن. تعمل كبريتات النيكل والأمونيوم على تغميق الراسب ، مما يعزز التباين.

أضف بارافورمالدهيد لإيقاف تفاعل التلوين، ثم اشطفه.

قم بتركيب الأقسام على شريحة وقم بتجفيفها بغسول الإيثانول.

اشطفها بالأيزوبروبانول والزيلين لتنظيف القسم وتحسين انتقال الضوء.

ضع وسيطا متصاعدا وضع غطاء عليه.

عند تصويرها تحت مجهر المجال الساطع ، داخل الخلايا العصبية القشرية ، تمتص الرواسب الضوء وتشتته ، مما يجعلها تبدو مظلمة.

في المقابل ، تنقل المناطق غير الملوثة التي تم تطهيرها الضوء وتظهر مشرقة.

يسلط هذا التباين الضوء على الوحدات القشرية كهياكل مظلمة غير مكتملة على خلفية أفتح ، تمثل مجموعات عصبية نشطة تشارك في معالجة المعلومات الحسية.

اغسل الأنسجة المقطعية في محلول HEPES لمدة 15 دقيقة بتحريض لطيف. أثناء الغسيل ، قم بإعداد محلول تلطيخ السيتوكروم أوكسيديز الطازج ، وأضف مكون DAB قبل استخدامه مباشرة. الآن ، احتضان الأقسام في محلول التلوين الطازج في درجة حرارة الغرفة باستخدام شاكر. وراقب. اعتمادا على مقدار التثبيت ، يمكن ملاحظة التلوين في غضون 10 دقائق ، أو قد يستغرق عدة ساعات.

إذا كان التفاعل يسير ببطء شديد ، فقم بزيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. لإيقاف رد الفعل ، انقل الأقسام إلى حمام بنسبة 4٪ PFA ، واتركها تحتضن لمدة 15 دقيقة مع تحريك لطيف. ثم اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام عازلة HEPES لمدة 10 دقائق لكل غسلة.

الآن ، قم بتركيب الأقسام وجففها على شرائح زجاجية ، وقم بتجفيفها باستخدام حمامات الإيثانول الأقوى تدريجيا. ثم اغسل الشرائح في الأيزوبروبانول لمدة 5 دقائق ، متبوعا بالزيلين لمدة خمس دقائق. بعد حمام الزيلين ، أضف على الفور وسط تثبيت سريع التصلب غير مائي الوسائط المائية سوف تحلل البقعة. بعد إضافة قسيمة الغطاء ، قم بتخزين الشرائح على حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم تصويرها.