تحليل الخلايا المناعية في الأنسجة العصبية للفأر باستخدام قياس التدفق الخلوي

خذ الخلايا المعزولة من الأعصاب الوركي للفأر والعقد الجذرية الظهرية أو DRGs.

احتضن بالأجسام المضادة الموسومة بالفلوروفور ضد CD45 و CD11b ، ومع الأجسام المضادة الموسومة بالبيوتين ضد معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية ، لتسمية الخلايا المناعية.

احتضان الستربتافيدين الموسوم بالفلوروفور الذي يرتبط بالبيوتين.

عالج بمثبت لتحقيق الاستقرار في البنية الخلوية.

أدخل عازلة نفاذية مع صبغة الحمض النووي الفلورية لاختراق الأغشية وتسمية النوى.

باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، قم بتمرير الخلايا عبر شعاع الليزر لتقييم الخصائص البصرية والفلورية.

قم بإزالة الركام ذات التألق الأعلى للحمض النووي لعزل الخلايا المفردة واكتشاف التألق من العلامات.

تحديد الخلايا التي تعبر عن CD45 ، وهي علامة مميزة للخلايا المناعية ، وتأكيد وجودها.

تعبر معظم الخلايا الإيجابية CD45 في DRG عن CD11b و MHC من الفئة الثانية ، مما يشير إلى خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة ، وهي غائبة في الأعصاب الوركي.

تكمل هذه التقنية التصوير لتحليل عدم تجانس الخلايا المناعية داخل الأنسجة العصبية.

في الكمبيوتر ، حدد القنوات المناسبة للكشف عن الفلوروفورات ذات الأهمية ، ومعدل التدفق المناسب للعينات ، والعدد الإجمالي للأحداث التي سيتم جمعها لكل عينة. يجب أن يكون الحد الأدنى لعدد الأحداث 1 مليون.

بعد ذلك ، قم بإنشاء مخططات مبعثرة تحت ورقة عمل عالمية للمبعثر الجانبي A مقابل المبعثر الأمامي A ، وكذلك لكل فلوروفور محل اهتمام مقابل المبعثر الأمامي A. أيضا ، قم بإنشاء طريقة عرض إحصائية تعرض عدد الأحداث ومتوسط شدة التألق للفلوروفورات المحددة.

حدد البوابة الأصلية P1 بناء على مخطط التبعثر من عناصر التحكم في التلوين DAPI فقط. قم بإرفاق العينة بقياس التدفق الخلوي وانقر فوق اكتساب. راقب مخطط DAPI مقابل FSC ، وقلل جهد قناة DNA Pacific Blue حتى يصبح عدد DAPI-plus مرئيا. باستخدام أداة بوابة المستطيل، ارسم مربعا حول مجموعة DAPI-plus. هذا يمثل بوابة P1. حدد المخططات المبعثرة لكل من الفلوروفورات واعرض أحداث DAPI-plus فقط. يمثل هذا مضان الخلفية لكل من الفلوروفورات.

باستخدام أداة بوابة المستطيل ، ارسم مربعا في مخططات المبعثر لكل من الفلوروفورات ، بدءا من 103 على المحور y. تمثل هذه البوابة المنطقة التي يجب أن توجد فيها الأحداث الإيجابية لكل علامة من العلامات المذكورة. اضبط الفولتية لكل من الفلوروفورات باستخدام أدوات التحكم في التلوين DAPI فقط. قم بإرفاق العينة بقياس التدفق الخلوي وانقر فوق اكتساب.

راقب موضع مجموعة DAPI-plus لكل من الفلوروفورات ، واضبط الفولتية المعنية بحيث تقع السكان خارج البوابة المستطيلة. بمجرد إعداد مقياس التدفق الخلوي ، قم بتشغيل العينات وتصدير ملفات التشتت الأمامية لمزيد من التحليل.