الاستئصال الانتقائي بالليزر أحادي الخلايا العصبية في يرقة الزرد باستخدام مجهر متحد البؤر

خذ محلول الاغاروز المسخن مسبقا الذي يحتوي على يرقة سمك الزرد المعدلة وراثيا مخدرة تعبر عن بروتين فلوري في الخلايا العصبية الحركية الشوكية.

انقل اليرقة إلى طبق زجاجي بحلقة الاغاروز.

باستخدام المجهر ، اقلب اليرقة على جانبها. ثم اسمح للأغروز بالتصلب ، مما يؤدي إلى شل حركة اليرقة.

أضف عازلة تحتوي على مخدر للحفاظ على التخدير.

ضع الطبق على مرحلة المجهر متحد البؤر واستخدم التصوير الساطع لتحديد منطقة الحبل الشوكي الظهري.

قم بالتبديل إلى وضع التألق لتصور الخلايا العصبية الحركية الفلورية.

حدد المستوى z المركزي لسوما الخلية لاستهداف الاستئصال بدقة.

تكوين معلمات التصوير للحصول على دقة عالية مع تقليل التلف الضوئي.

بمجرد أن يصبح المستوى z المطلوب في بؤرة التركيز ، قم بإجراء الاستئصال على منطقة الخلايا العصبية المستهدفة باستخدام ليزر فوق بنفسجي مركز.

تعطل طاقة الليزر الهياكل الخلوية ، مما يتسبب في فقدان التألق وموت الخلايا. يؤكد فقدان التألق الذي لا رجعة فيه الاستئصال الدقيق دون التأثير على الخلايا المحيطة.

استخدم ماصة قابلة للتعديل لسحب يرقة واتركها تغرق في أسفل الحافة. قم بإسقاط اليرقة في الحد الأدنى من السائل في الاغاروز المسخن مسبقا ، ثم ارسم السمكة مع الاغاروز وقم بتوزيعها بسرعة في طبق زجاجي معد مسبقا بحجم 35 ملم. تحت مجهر التشريح ، استخدم فرشاة رسم قياسية لوضع ، أو متعددة ، داخل الاغاروز على جوانبها ، بحيث يكون الجسم والذيل مسطحين.

اترك السمكة المغموسة لمدة 10 إلى 15 دقيقة حتى يتماسك الاغاروز بإحكام. بعد ذلك ، استخدم ما يقرب من ملليلترين من ماء البيض مع التريكان لتعبئة طبق بتري الذي يبلغ طوله 35 ملم بعناية. ضع طبق بتري مع يرقة مدمجة على مرحلة المجهر متحد البؤر ، وباستخدام إضاءة Brightfield والتكبير 40X ، ركز على الجانب الظهري للحبل الشوكي الحيواني. قم بالتبديل إلى إعداد الفلورسنت المناسب ، وتصور الهيكل محل الاهتمام للتأكد من أن جميع معلمات التصوير هي حسب الحاجة للاستئصال اللاحق.

لتحديد سمك هيكل الاستئصال بالليزر بالأشعة فوق البنفسجية ، استخدم محرك الأقراص Z للتحقق من الجزء العلوي والسفلي من الهيكل محل الاهتمام عن طريق التركيز يدويا لأعلى ولأسفل. سجل المستوى Z يدويا الذي سيتم استئصاله ، على سبيل المثال ، مركز الخلية. لإجراء الاستئصال بالليزر ، ابدأ معالج FRAP بالنقر فوق القائمة المنسدلة أعلى قائمة البرامج.

من النافذة الجديدة ، حدد معلمات الصورة لنهج الاستئصال عن طريق تحديد التنسيق وسرعة المسح والمتوسط. إذا لم يتم تحديد المستوى Z للاستئصال بالفعل ، فاضغط على الزر المباشر وركز من خلال العينة حتى يتم التركيز على بنية الفلورسنت ، أو المستوى Z المطلوب استئصاله في البؤرة. بمجرد تعيين معلمات الصورة العامة ، قم بالوصول إلى خطوة التبييض للتحكم في مكونات الاستئصال المحددة ، ثم قم بتشغيل الليزر 405 نانومتر عن طريق تنشيطه لإجراء التبييض.

بعد ذلك ، استخدم خيار التكبير لزيادة كثافة التبييض عند عائد الاستثمار المحدد عن طريق تقليل مجال المسح ، وبالتالي زيادة وقت السكون إلى أقصى حد. حدد عائد استثمار واحد أو أكثر للاستبعاد باستخدام أي من أدوات الرسم في نافذة الحصول على الصور. استهدف التل المحوري ، على سبيل المثال ، باستخدام أداة الرسم الدائرية التي تتراوح من 4 إلى 8 ميكرومتر تقريبا.

بعد إنشاء عائد الاستثمار، حدد زر الدورة الزمنية وقم بتأكيد عدد الدورات التي سيتم مسح عائد الاستثمار فيها وإلغاء المشاركات. اختر إطارات ما قبل التبييض وما بعد التبييض حسب الرغبة للسماح بإلقاء نظرة عامة على الصورة بأكملها قبل عملية التبييض وبعدها مباشرة.

تسمح هذه الإعدادات للباحثين بطبقات متعددة من الصقل. من خلال ضبط طاقة الليزر ، وسرعة المسح ، ومتوسط الخط ، وحجم منطقة الاهتمام ، والتكرار ، توفر هذه التقنية درجة عالية من الحرية في التسبب في الإجهاد أو الموت في الخلايا الفردية.

بعد إنشاء جميع معلمات الاستئصال الضرورية ، اضغط على تشغيل التجربة وراقب كفاءة الاستئصال. راجع بروتوكول النص للحصول على تفاصيل إضافية.