التصوير المزدوج الفلوري لتحديد الخلايا قليلة التغصن المتمايزة

خذ مزرعة الخلايا السليفة قليلة التغصن (OPCs) ، المعزولة من دماغ جرو الفئران ، والتي تم حثها على التمايز إلى الخلايا قليلة التغصن. تم إصلاح الخلايا للحفاظ على الهندسة الخلوية.

تعبر الخلايا قليلة التغصن المتمايزة عن بروتين المايلين الأساسي ، أو MBP ، وهي علامة على الخلايا قليلة التغصن الناضجة ، في حين أن كل من OPCs والخلايا المتمايزة تعبر عن عامل نسخ الخلايا قليلة التغصن 2 ، أو Olig2.

ضع محلولا حاجب النفاذية واحتضانه بالتحريض ، ونفاذية الأغشية الخلوية ومنع مواقع الربط غير المحددة.

أضف الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف العلامات واحتضانها بالتحريض للسماح بالارتباط.

اغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة ، ثم أضف أجساما مضادة ثانوية مختلفة مترافقة بالفلوروفور خاصة بالأجسام المضادة الأولية واحتضانها بالتحريض.

اغسل الخلايا ثم ضعها في نظام تصوير مزدوج مضانة.

استخدم ضوءا ذا أطوال موجية محددة لإثارة الفلوروفورات المميزة واكتشاف الإشارات المنبعثة لتصور العلامات.

تحديد الخلايا قليلة التغصن المتمايزة التي تعبر عن olig2 و MBP بين OPCs غير المتمايزة التي تعبر فقط olig2.

أحضر الطبق إلى درجة حرارة الغرفة. استنشق الآبار ، وأضف 250 ميكرولتر من DPBS تحتوي على 5٪ NGS و 0.1٪ Triton X-100. احتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز مداري لطيف. تحضير محلول الحضانة الأولي عن طريق تخفيف الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل MBP والجسم المضاد متعدد النسيلة للأرانب المضاد ل OLIG2 في DPBS الذي يحتوي على 5٪ NGS. بعد ذلك ، احتضان الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية طوال الليل لمدة 16 إلى 18 ساعة مع اهتزاز مداري لطيف.

أثناء غسل الطبق ، قم بإعداد محلول الحضانة الثانوي عن طريق تخفيف الأجسام المضادة للفأر 680 والأجسام المضادة للأرانب 800 في DPBS التي تحتوي على 5٪ NGS. بعد ذلك ، قم بشفط الغسيل النهائي وأضف 250 ميكرولتر من محلول الحضانة الثانوي. احم اللوحة من الضوء ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز مداري لطيف.

بعد ذلك ، قم بمسح اللوحة باستخدام نظام تصوير قادر على اكتشاف انبعاثات مضان 700 نانومتر و 800 نانومتر. كنقطة بداية، اضبط الإزاحة البؤرية على 3 والحساسيات على 1.5 ل MBP، و 5.0 للأكتين، و 3.5 ل OLIG2. اضبط قيم الحساسية حسب الحاجة لتجنب التعرض المفرط للإشارة.