تحديد الأنواع الفرعية لخلايا العقدة الشبكية للفأر من خلال تتبع الفلورسنت

ضع نسيجا شبكيا معزولا من فأر معدل وراثيا مع خلايا عقدة شبكية أو RGCs مسمى بالفلورسنت في غرفة التسجيل.

يتم نقل المعلومات المرئية إلى RGCs ، التي تنقلها محاورها إلى الدماغ عبر العصب البصري.

تتميز الأنواع الفرعية RGC بالأنماط المتفرعة للتشعبات ، والتي تنقسم إلى طبقات فرعية داخل طبقة الشبكية الداخلية.

افرد أنسجة الشبكية وقم بتثبيتها باستخدام مرساة الأنسجة.

انقل الغرفة إلى مرحلة المجهر وقم ببث محلول مؤكسج للحفاظ على بقاء RGC.

باستخدام إضاءة الأشعة تحت الحمراء ، حدد RGCs الفلورية.

ضع ماصة تحتوي على متتبع الفلورسنت على RGC.

استخدم ضغطا إيجابيا لمنع الانسداد.

قم بالتبديل إلى الضغط السلبي، واسحب الغشاء إلى الماصة لتشكيل مانع للتسرب استخدم

الشفط لتمزق الغشاء، وإنشاء تكوين خلية كاملة يسهل انتشار التتبع في التشعبات.

راقب التشكل التغصني والتقسيم الطبقي لتحديد الأنواع الفرعية RGC.

اغسل شبكية العين في محلول خارج الخلية المؤكسج وانقلها إلى غرفة تسجيل زجاجية ذات قاع زجاجي باستخدام ماصة نقل بلاستيكية. بعد ذلك ، استخدم الملقط لتسطيح الأنسجة بعناية بحيث تكون طبقة المستقبلات الضوئية متجهة لأسفل. قم بإزالة السوائل الزائدة باستخدام ماصة. وقم بتثبيت الأنسجة باستخدام حلقة بلاتينية بشبكة من النايلون. ثم املأ الغرفة بالمحلول المؤكسج خارج الخلية وقم بتثبيتها على مرحلة المجهر. قم بتنقيم الأنسجة بمحلول خارج الخلية المؤكسج بسرعة 2 إلى 4 ملليلتر في الدقيقة.

للتحضير لهذا الإجراء، اسحب بعض الماصات الزجاجية الدقيقة للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية باستخدام مجتذب ماصة دقيقة. راقب طبقة الخلايا العقدية باستخدام بصريات IR-DIC. ثم حدد GFP بالإضافة إلى الخلايا العقدية باستخدام التألق عند حوالي 480 نانومتر. بعد ذلك ، حدد موقع الماصة المملوءة بمحلول داخل الخلايا في DIC. قم بتطبيق ضغط إيجابي طفيف وصفر أي إزاحة للجهد على مكبر الصوت.

بعد ذلك، قم بخفض الماصة الزجاجية الدقيقة على خلية موجبة GFP وقم بتطبيق خطوات أمر جهد الاختبار لمراقبة مقاومة مانع التسرب. يجب أن يشكل الضغط السلبي ختم جيجا أوم بين الماصة وغشاء الخلية. بعد تشكيل ختم مستقر ، قم بتمزيق الغشاء عن طريق تطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي للوصول إلى الخلية بأكملها. انتظر من دقيقة إلى دقيقتين حتى تمتلئ تشعبات الخلية بتتبع الفلورسنت.