موسوعة JoVE للتجارب
علم الأعصاب
0 مشاهدة • 4:33 دقيقة • May 29th, 2025
ابدأ بمجموعة التروية الموضوعة على مسرح المجهر المقلوب.
تحتوي مجموعة التروية على عصب محيطي مقطوع مثبت بين غطاء وشريحة قناة صغيرة مع نضح ملحي مستمر.
تعبر المحاور النخاعية للعصب عن الخيوط العصبية الخضراء الموسومة بالفلوروفور.
باستخدام إضاءة المجال الساطع ، ركز على المحاور النخاعي.
قم بالتبديل إلى الوضع متحد البؤر ، والتبييض الضوئي بقوة ليزر عالية ، ثم التقط صورة مرجعية منخفضة التألق الذاتي باستخدام طاقة ليزر منخفضة.
ارسم خطوطا متوازية على طول المحور العصبي لتحديد طول نافذة التنشيط الضوئي. استخدم هذا كدليل لإنشاء منطقة تنشيط مستطيلة.
قم بإضاءة هذه المنطقة بطول موجي محدد لتنشيط الخيوط العصبية ذات العلامات الفلورية الخضراء ، مما يؤدي إلى تألقها. احصل على الصورة.
بعد التنشيط ، التقط صورا بفاصل زمني.
بمرور الوقت ، تتحرك الخيوط العصبية الفلورية في كلا الاتجاهين وتنتشر في المناطق المجاورة المرافقة.
يؤكد ظهور التألق في المناطق المجاورة لمنطقة التنشيط نقل الخيوط العصبية.
أمسك الطرف القريب من العصب وضعه ببطء على زلة غطاء. ثم قم بتصويبها تحت التوتر اللطيف. ضع شريحة القناة الدقيقة فوق العصب مع الانزلاق المحزز لأسفل وضع اتجاه التدفق الموازي للعصب. اقلب زلة الغطاء ومجموعة القناة الصغيرة وضعها في مبيت غرفة التروية مع الشريحة المقابلة للحشية الخارجية.
لتأمين غرفة التروية ، ضعها في الغلاف المعدني وقم بتدوير حلقة القفل. اضغط ببطء على مكبس المحقنة المالحة واملأ غرفة التروية. حافظ على أنبوب المدخل والمخرج وقارورة المخرج والحقنة مرتفعة فوق الغرفة نفسها في جميع الأوقات أثناء الإعداد والتصوير. انقل مجموعة التروية إلى مرحلة المجهر المقلوب وقم بتركيب المحقنة المالحة في مضخة الحقنة. ثم قم بتشغيل المحرك واضبط السرعة لمعدل تدفق يبلغ 0.25 مل لتر في الدقيقة.
قم بتوصيل سخان المحلول المضمن واضبطه على 37 درجة مئوية. قم بتوصيل السخان الموضوعي واضبطه على 37 درجة مئوية. ضع الزيت على الهدف وأدخل غرفة التروية في حامل المرحلة. ضع الزيت على وسادة سخان الغرفة وقم بتثبيتها في غرفة التروية. ثم قم بتوصيله واضبطه على 37 درجة مئوية.
قم بقفل غرفة التروية في محول المرحلة واجعل الزيت الموضوعي ملامسا لزلة الغطاء الموجودة على الجانب السفلي من الغرفة. استخدم إضاءة المجال الساطع للتركيز على طبقة المحاور العصبية الموجودة على السطح السفلي للعصب الأقرب إلى سطح انزلاق الغطاء. يمكن التعرف على المحاور النخاعية من خلال وجود غمد المايلين ، والذي يمكن رؤيته تحت إضاءة الضوء المنقولة عن طريق المجال الساطع دون تحسين التباين.
احصل على صورة مرجعية للحقل الساطع ، وتسجيل اتجاه العصب. ثم احصل على صورة متحد البؤر باستخدام ليزر 488 نانومتر ومرشح انبعاث مناسب ل GFP القابل للتنشيط الضوئي. اضبط طاقة الليزر على ما يقرب من خمسة أضعاف طاقة التصوير العادية واحصل على صورة بوقت تعريض من ثلاث إلى أربع دقائق. ثم احصل على صورة متحد البؤر أخرى لتسجيل التألق الذاتي قبل التنشيط بعد خطوة التبييض.
ارسم خطا موازيا للمحاور بطول يساوي حجم نافذة التنشيط المطلوب لصورة المجال الساطع. باستخدام هذا الخط كدليل ، ارسم منطقة مستطيلة ذات اهتمام عبر مجال الرؤية بشكل عمودي على المحاور. قم بتنشيط تألق GFP في هذه المنطقة عن طريق إثارة النمط باستخدام ضوء 405 نانومتر ، مع التأكد من الحصول على الصورة قبل التنشيط وبعده مباشرة. عند انتهاء التنشيط ، ابدأ مؤقتا مدته دقيقة واحدة. عندما تنفجر ، ابدأ في الحصول على سلسلة بفاصل زمني.