الفحص المجهري ثنائي الفوتون لتصوير مورفولوجيا الخلايا العصبية في جرو الفأر

ابدأ بإعداد ضوء الإثارة للمجهر ثنائي الفوتون.

خذ جرو فأر معدلا وراثيا مخدرا مع نافذة تصوير زجاجية دائرية ولوحة رأس مزروعة في جمجمته.

تعبر الخلايا العصبية عن بروتينات الفلورسنت الحمراء لتسهيل التصوير.

قم بتنظيف نافذة التصوير الزجاجية وقم بتأمين الجرو في مرحلة التصوير ثنائي الفوتون.

قم بمحاذاة نافذة التصوير مع هدف المجهر عن طريق ضبط رأس الجرو.

استخدم وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة جسم الجرو.

اضبط معدل تدفق التخدير.

ضع قطرة ماء على الغطاء ، ثم اخفض العدسة الموضوعية للمجهر.

يستخدم الفحص المجهري ثنائي الفوتون فوتونين من الضوء لتنشيط بروتينات الفلورسنت ، مما يسمح بتصوير عصبي مفصل مع الحد الأدنى من ضوضاء الخلفية والتبييض الضوئي.

التقط صورا للخلايا العصبية على أعماق مختلفة لتصور هيكلها أخيرا

، قم بتكديس الصور لإنشاء تمثيل ثلاثي الأبعاد للخلايا العصبية ، بما في ذلك إسقاطاتها العصبية ، لدراسة التغيرات المورفولوجية المرتبطة بالنمو.

لبدء التصوير ، قم أولا بتعيين الطول الموجي لليزر ثنائي الفوتون. لإثارة RFP ، استخدم طولا موجيا يبلغ 1,000 نانومتر. امسح سطح زلة الغطاء بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بتوصيل الجرو المخدر بلوحة التيتانيوم في مرحلة التصوير باستخدام قضيب التيتانيوم. استخدم مرحلة مقياس الزوايا لضبط الرأس بحيث يكون انزلاق الغطاء موازيا للعدسة الموضوعية.

حافظ على درجة حرارة جسم الجرو أثناء التصوير ، باستخدام وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية ، وقلل تركيز الأيزوفلوران إلى 0.7٪ إلى 1٪. ضع مرحلة التصوير تحت العدسة الموضوعية 20X للمجهر ثنائي الفوتون. ضع قطرة واحدة من الماء على زلة الغطاء.

اضبط البرنامج للحصول على صور z-stack على فترات 1.4 ميكرون. لتصوير الخلايا العصبية من الطبقة الرابعة ، اضبط عرض z على ما بين 150 و 300 ميكرون لتصوير التشكل التغصني بالكامل. استخدم المسح البطيء والمتوسط للحصول على صور واضحة توضح مورفولوجيا الخلايا العصبية.

عادة ما يستغرق الأمر أكثر من 20 دقيقة للحصول على التشكل الشجيري بالكامل.