التصوير الحيوي للدراسة عابرات الكالسيوم في ذبابة الفاكهة في هياكل الدماغ

قم بتأمين ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا الجثمود مع كشف رأسها في غرفة التسجيل على مرحلة المجهر الفلوري.

يتكون جسم فطر الذبابة من خلايا عصبية تعبر عن بروتين اندماج حيوي حساس للكالسيوم ، والذي يتم تنشيطه بواسطة عامل مساعد محمل مسبقا.

قم بتوصيل أنبوب التروية بالغرفة. حدد أجسام الفطر الفلوري ، مع التركيز على الكأس والفصوص الإنسية. تأكد من التصريف باستخدام المخزن المؤقت.

اضبط معلمات التصوير وركز على الكأس والفصوص الإنسية. في الظلام ، احصل على صور مضان أساسية لأجسام الفطر قبل التعرض للمنشطات.

يتدفق النيكوتين في مخزن مؤقت يحتوي على الكالسيوم لتنشيط مستقبلات أستيل كولين النيكوتين ، مما يؤدي إلى تدفق الكالسيوم وانبعاث الضوء الحيوي.

يغسل بمحلول عازل لاستعادة الظروف الأساسية.

قم بنشر كلوريد البوتاسيوم لإزالة استقطاب الخلايا العصبية، مما يؤدي إلى إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا وانبعاث إشارة الإضاءة الحيوية.

يغسل بالعازلة لاستعادة الظروف الأساسية.

تحليل الصور لتقييم نشاط الكالسيوم المكاني والزماني في الكأس والفصوص الإنسية.

- بعد ذلك ، ضع العينة على الحامل تحت المجهر ، واضبط التكبير على 5x. ثم أدخل أنبوب التروية في القناة من خلال الثقب. اضبط المجهر على وضع الفلورسنت ، ثم في المنتصف ، واجعل أجسام الفطر في بؤرة التركيز. بمجرد أن تصبح أجسام الفطر في بؤرة التركيز ، قم بتغيير التكبير إلى 20x. أعد توسيط الصورة واضبط التركيز.

بعد ذلك ، ضع جهاز الصرف فوق حوض الصرف ، واضبط ارتفاع تحويلة الصرف بحيث يكون الطرف فوق حوض الصرف مباشرة. بعد ذلك ، اغسل العينة بمحلول Ringer لمدة 30 ثانية للتحقق من وجود تصريف مناسب. أخيرا ، اسحب الدرع لأسفل لإغلاق الجهاز من أي ضوء خارجي.

باستخدام النظام الآلي في برنامج Photon Imager ، قم بإجراء تعديلات دقيقة على التركيز ، والتقط صورة فلورية مرجعية لأجسام الفطر. اضبط موضع مربعات منطقة الاهتمام فوق الكأس وأجسام الخلايا والفصوص الإنسية بالنقر فوق المربعات وسحبها إلى موضعها أثناء الضغط على عنصر التحكم.

الآن ، سجل قيم خط الأساس لمدة 5 إلى 10 دقائق. بعد ذلك ، اقلب المفتاح لبدء تدفق النيكوتين. في الوقت نفسه ، اضغط على Enter ، وأضف ملاحظة للدلالة على أن تدفق النيكوتين قد بدأ. بعد دقيقة واحدة ، أوقف التدفق ، وقم بتدوين ملاحظة أخرى في السجل تشير إلى توقف التدفق. ثم اغسل العينة بمحلول رينجر لمدة خمس دقائق.

أثناء تعافي العينة ، قم بإيقاف تشغيل الغسيل ، واضبط المؤقت لمدة خمس دقائق إضافية ، واستعد لبدء تدفق كلوريد البوتاسيوم. عندما تكون جاهزا للبدء ، ابدأ تدفق كلوريد البوتاسيوم ، وأدخل 100 مللي مولار من كلوريد البوتاسيوم في سجل العينة. بعد دقيقة واحدة ، أوقف التدفق وأدخل كلوريد البوتاسيوم مغلقا في سجل العينة. بعد ذلك ، اغسل العينة بمحلول Ringer لمدة دقيقة واحدة وقم بتبديل المجهر إلى وضع الفلورسنت. التقط صورة فلورية نهائية ، ثم قم بإيقاف تشغيل محلول Ringer وإزالة العينة.