الفحص المجهري ثنائي الفوتون لمراقبة ديناميكيات الكالسيوم في المستقبلات الضوئية المخروطية لشبكية العين

ضع غطاء يحتوي على نسيج شبكية الفأر المثبت على الغشاء تحت مجهر ثنائي الفوتون.

يعبر النسيج عن مستشعر حيوي للكالسيوم قائم على FRET في المستقبلات الضوئية المخروطية.

باستخدام هدف الغمر في الماء ، ركز على الأنسجة.

تحت إضاءة الخلفية ، تظل أطراف المحور العصبي المخروطية غير مستقطبة ، مما يسمح بتدفق الكالسيوم.

يغير ارتباط الكالسيوم داخل الخلايا شكل المستشعر الحيوي ، مما يجعل الفلوروفورات المانحة والمتقبلة أقرب إلى الفلوروفورات.

ابدأ التصوير ثنائي الفوتون.

يركز ليزر المجهر الضوء القريب من الأشعة تحت الحمراء منخفض الطاقة في الأنسجة.

في النقطة المحورية لليزر ، يثير فوتونان المستشعر الحيوي في وقت واحد ، مما يؤدي إلى نقل الطاقة من المتبرع إلى المستقبل.

هذا يزيد من مضان المستقبل مع تقليل مضان المانح.

احسب نسبة التألق.

بعد ذلك ، قم بتحفيز الضوء لفرط استقطاب المخاريط ، مما يقلل من مستويات الكالسيوم داخل الخلايا.

يؤدي هذا إلى إعادة تشكيل المستشعر الحيوي ، مما يمنع نقل الطاقة من المتبرع إلى المستقبل ويقلل من نسبة التألق.

سجل الاستجابات لتحليل ديناميكيات الكالسيوم التي يستثارها الضوء في أطراف المحاور المخروطية.

انقل شريحة من غرفة الاحتجاز إلى غرفة التسجيل وابدأ على الفور في حققها بمحلول كربوهيدرات مؤكسج خارج الخلية. حافظ على معدل تدفق التروية يبلغ 2 مل في الدقيقة ودرجة حرارة 37 درجة مئوية في غرفة التسجيل. استخدم هدف الغمر في الماء 20x و 0.95 NA وكاميرا CCD مع مؤشر LED بالأشعة تحت الحمراء أسفل غرفة التسجيل لتحديد موقع شريحة الشبكية.

ابدأ نظام التصوير ثنائي الفوتون ، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بتشغيل الليزر واضبطه على 860 نانومتر. قم بتشغيل قناتي الكشف للتصوير الفلوري ل ECFP والسترين. بعد ذلك ، باستخدام برنامج الحصول على الصور ، تحكم في المجهر ثنائي الفوتون لمسح وتحديد صف من المحطات المخروطية للتسجيل. اضبط الحصول على الصور على صورة مقاس 128 × 16 بكسل أو تكوين مشابه.

قصر المنطقة الممسوحة ضوئيا على الأطراف المخروطية لتجنب تبييض الأصباغ الضوئية في الأجزاء الخارجية. قم بتشغيل الليزر. اسمح للمخاريط بالتكيف مع ليزر المسح الضوئي وضوء الخلفية المنبهة لمدة 20 إلى 30 ثانية قبل تقديم محفزات الضوء أو تطبيق العوامل الدوائية. الآن ، ابدأ في عرض المحفزات التعسفية. يتم إنشاء المحفزات عن طريق تعديل شدة مصباحي LED بمرور الوقت ، باستخدام لوحة معالجات دقيقة يتم التحكم فيها بواسطة برنامج مخصص. بعد ذلك ، ابدأ في تسجيل قناتي التألق في وقت واحد باستخدام برنامج الحصول على الصور المعني.