تصوير الخلايا الحية للهجرة النووية الدبقية لمولر أثناء تجديد شبكية الزرد

ابدأ بمستحضر شبكية ظهرية مدمجة في الاغاروز من سمكة الزرد المعدلة وراثيا ، مثبتة في فلوروديش مع وسائط.

شبكية العين تلفا في المستقبلات الضوئية الناجمة عن الضوء وتحتوي على خلايا مولر الدبقية أو MGCs مع نوى تعبر عن GFP.

ضع الطبق في غرفة مجهر متعددة الفوتونات.

باستخدام إضاءة المجال الساطع ، ركز على شبكية العين.

قم بالتبديل إلى وضع التألق لتحديد موقع MGCs.

قم بتكوين مكدس z من طبقة الخلية العقدية أو GCL إلى الطبقة النووية الخارجية أو ONL.

ابدأ التصوير المباشر.

تطلق المستقبلات الضوئية التالفة TNF-α ، مما يؤدي إلى تنشيط MGCs.

تهاجر نوى MGC بشكل أساسي داخل الطبقة النووية الداخلية أو INL لتكرار الحمض النووي الخاص بها.

بعد ذلك ، تهاجر النوى قمي إلى ONL للخضوع للانقسام ، مما ينتج عنه أسلاف عصبية.

بعد الانقسام ، تهاجر نوى وأسلاف MGC بشكل أساسي إلى INL.

تتكاثر الأسلاف ، وتهاجر إلى موقع الإصابة ، وتتمايز إلى مستقبلات ضوئية ، مما يتيح تجديد الشبكية.

تحليل الصور الملتقطة لتصور الهجرة النووية.

في برنامج الحصول على الصور ، افتح نوافذ A1 MP GUI و TiPad و A1 Compact GUI و ND Acquisition. للتصوير متعدد الفوتونات، تأكد من اختيار خيار IR NDD في نافذة واجهة المستخدم الرسومية المدمجة A1. بعد ذلك ، في حقل الإعداد ، حدد IR-DM لأول مرآة ثنائية اللون وتحقق من ضبط مرشح ممر النطاق على 525 إلى 50 للحصول على مضان GFP.

بعد ذلك ، قم بتشغيل ليزر الأشعة تحت الحمراء في نافذة واجهة المستخدم الرسومية A1 MP. سوف يستغرق الأمر بضع دقائق حتى يصبح الليزر جاهزا. بعد ذلك ، اضبط الطول الموجي على 910 نانومتر لإثارة مضان GFP ومحاذاة الليزر بالنقر فوق المحاذاة التلقائية زر.

بعد وضع ثقافة الشبكية على مرحلة المجهر متعدد الفوتون ، تأكد من إطفاء أضواء الغرفة والمعدات قبل فتح الغالق لتجنب التعرض المفرط لأنبوب مضاعف الضوء. لتقليل مستويات الضوضاء ، ضع المجهر في بيئة مظلمة.

احصل على صور لمجال رؤية 300 × 300 بكسل عند تكبير/تصغير 2، والتي تم تعيينها في نافذة منطقة المسح الضوئي، ووقت سكون البكسل البالغ 4.8 ميكروثانية لكل بكسل تم اختياره في نافذة واجهة المستخدم الرسومية المدمجة A1. قم بإعداد طاقة الليزر تقريبا عن طريق تغيير منطقة الاستحواذ في نافذة واجهة المستخدم الرسومية A1 MP والكسب في نافذة واجهة المستخدم الرسومية A1 Compact.

الآن ، ركز على طبقة الخلية العقدية واضبط المستوى البؤري العلوي للمكدس z في النافذة الفرعية Z داخل نافذة اكتساب ND. حرك المستوى البؤري عبر مستوى الطبقة النووية الخارجية ، والتي تتميز بوجود خلايا GFAP وإيجابية GFP ذات علامات خافتة مستديرة ومتضخمة بالنسبة لنظيراتها في الطبقة النووية الداخلية.

قم بتعيين هذا المستوى كالجزء السفلي من z-stack. بعد ذلك ، قم بتعيين حجم الخطوة z بين 0.7 إلى 1 ميكرومتر. لإعداد تصحيح شدة z، افتح نافذة تصحيح شدة Z واختر من ND لتعيين نطاق z-stack. ثم انقر فوق المستوى البؤري السفلي في نافذة Z Intensity Correction واضبط شدة الليزر والكسب.

بعد ذلك، انقر فوق السهم الموجود بجوار قيم z في نافذة تصحيح شدة Z لتأكيد الإعدادات التي تظهر لاحقا ضمن إعدادات الجهاز في نافذة تصحيح شدة Z للمستوى البؤري المختار. كرر العملية للطائرات الوسطى والعليا ، مما يزيد من قوة الليزر والكسب.

قم بتعيين منطقة الاستحواذ في نافذة واجهة المستخدم الرسومية A1 MP وتجنب تحديد منطقة اكتساب أكبر من 15 وكسب أعلى من 126 في بداية التصوير للتحايل على التبييض الضوئي وزيادة مستويات الضوضاء. بعد ذلك ، اختر تصحيح الشدة النسبية في نافذة تصحيح شدة Z. في النافذة الفرعية للسلاسل الزمنية لنافذة اكتساب ND، اضبط المدة على ثماني ساعات والفاصل الزمني على عدم التأخير. ثم ، انقر فوق تشغيل Z Correction في النافذة الفرعية Z-Stack لنافذة اكتساب ND للحصول على سلسلة زمنية ثلاثية الأبعاد.