التصوير خارج الجسم الحي لهجرة الخلايا الحبيبية المخيخية بعد الولادة باستخدام تنظير الماكروس متحد البؤر

ابدئي بشريحة مخيخية تم الحصول عليها من دماغ جرو الفئران بعد الولادة في طبق متعدد الآبار يحتوي على وسائط.

قم بإزالة الوسائط واحتضان الشريحة في محلول صبغة فلورية سيتوبلازمية لتسمية الخلايا الحبيبية (GCs).

انقل الشريحة إلى غشاء إدراج بئر وقم بإزالة أي صبغة زائدة.

قم بإزالة الملحق واملأ البئر بالوسائط. ثم استبدل الملحق وأضف الوسائط لتغطية المنديل.

احتضن للسماح للأنسجة بالالتصاق بالغشاء الداخلي.

انقل اللوحة إلى حاضنة متصلة بمنظار متحد البؤر وضع غطاء زجاجي فوق اللوحة.

اضبط ظروف الثقافة ، واحتضن الأنسجة أكثر ، ثم ابدأ في التصوير.

عند إضاءة الليزر ، تتألق GCs المسماة.

التقط صورا بفاصل زمني لتصور الهجرة الشعاعية ل GCs عبر الطبقة الجزيئية للمخيخ.

باستخدام برنامج التصوير ، قم بتحليل مسافة الهجرة ل GCs.

بعد تقطيع العينة إلى شرائح ، استخدم ماصة لمبة بيضاء مقطوعة لنقلها مع بعض HBSS إلى صفيحة من ستة آبار. قم بتحميل ما يصل إلى ثلاث شرائح في كل بئر. بعد ذلك ، بعد إفراغ الوسائط في كل بئر محملة ، أضف خمسة ملليلتر من محلول التحميل الذي يحتوي على 10 ميكرومولار من صبغة الفلورسنت. لحماية العينات من الضوء ، قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم. ثم ضع اللوحة على مطفرة مضبوطة على 35 دورة في الدقيقة. دع اللوحة تحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح للصبغة بتسمية الخلايا.

الآن ، انقل الشرائح كما كان من قبل إلى غشاء ملحق transwell الذي يحتوي على ثلاثة مسام ميكرون. ثم استنشق وسط التحميل ، مع ترك الشرائح فقط. الآن ، قم بإزالة الملحق والشرائح لملء البئر ب 1.9 مل من DMEM. ثم ضع الملحق مرة أخرى وأضف 100 ميكرولتر أخرى من DMEM لتغطية الأنسجة.

احتضان هذا المستحضر لمدة ساعتين ، وبعد ذلك ستكون الخلايا الحبيبية مرئية. انقل اللوحة بدون غطاء إلى غرفة بيئية ذات تدفق غاز ثابت على منظار ضخامة متحد البؤر. ثم ضع غطاءا زجاجيا على إدراج اللوحة في المنظار الكبير متحد البؤر. بالنسبة لتجارب الفاصل الزمني ، دع الخلايا تحتضن في الغرفة لمدة ساعتين إضافيتين قبل المتابعة.

لتصور الخلايا الحبيبية المهاجرة في شرائح الأنسجة ، قم بإضاءة المستحضر بضوء 488 نانومتر واستخدم هدفا جافا 2X. كشف انبعاثات التألق من 500 إلى 530 نانومتر. باستخدام ImageJ، لكل صورة لفيلم اللقطات المتتابعة، قم بإجراء عرض مكدس Z باستخدام وضع الانحراف المعياري.

اضبط التباين ومستويات السطوع لكل صورة بحيث يسهل رؤية الخلايا الحبيبية المصنفة. الآن ، اختر ال ال التتبع اليدوي المكون الإضافي من قائمة تحليل الجسيمات. استخدم المكون الإضافي للنقر على النقطة المركزية لكل جسم خلية مسمى طوال تسلسل صورة الفاصل الزمني. ثم قم بتصدير بيانات التتبع الأولية إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.

أعد تنظيم بيانات التتبع الأولية المصدرة من ImageJ باستخدام أداة منزلية ذكية تحدد كل خلية والمواضع المرتبطة بها. باستخدام البرنامج ، احسب إجمالي المسافة المقطوعة ومتوسط سرعة الهجرة لكل خلية.