JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأعصاب
0 مشاهدات • 3:06 د • June 17th, 2025
ابدأ مع يرقات الزرد المعدلة وراثيا المخدرة في غرفة تركيب تحتوي على عازلة فسيولوجية مؤكسجة تحت مجهر مجسم.
يحتويالمخيخ في الدماغ على خلايا عصبية بركنجي معدلة وراثيا تعبر عن بروتينات السيتوبلازم الفلورية.
قم بإزالة الوسط الزائد ، ثم أضف الاغاروز المنصهر لشل حركة اليرقات للحصول على تصوير مستقر.
قم بتوجيه الجانب الظهري لليرقات لأعلى لتصور المخيخ.
بمجرد أن تصلب ، قم بقص الاغاروز الزائد. باستخدام إبرة زجاجية ، قم باستئصال الجلد المصطبغ الذي يغطي الدماغ لفضحه.
اقلب كتلة الاغاروز على غرفة تصوير تحتوي على الاغاروز المنصهر للتصوير تحت المجهر المقلوب.
أضف المخزن المؤقت الفسيولوجي للحفاظ على وظيفة الخلايا العصبية.
ضع الغرفة تحت مجهر متحد البؤر المقلوب. قم بتطبيق ضوء الإثارة لإثارة البروتينات الفلورية ، مما يتيح تصور الخلايا العصبية المسماة.
خلاياالجلد المصطبغة ، إذا لم تتم إزالتها ، تنتشر وتمتص ضوء الإثارة ، مما يقلل من شدة التألق.
تعمل إزالة الجلد على تحسين تغلغل الضوء لتعزيز شدة التألق ، مما يسهل تصور الخلايا العصبية.
لتضمين اليرقة ، استخدم ماصة باستور لنقل اليرقة المخدر إلى غرفة تركيب تحت مجهر مجسم. إذا كانت أي يرقة لا تزال قادرة على الحركة ، فلا تستخدم الأسماك للتجربة حتى تصبح الأسماك غير قادرة تماما على الحركة. عندما تكون اليرقة غير متحركة ، قم بإزالة الوسط الزائد بعناية وأضف على الفور ما لا يقل عن 1 ملليلتر من الاغاروز منخفض الذوبان على اليرقة.
قم بتوجيه سمك الزرد بحيث تكون المنطقة الظهرية متجهة لأعلى بالقرب من سطح الاغاروز قدر الإمكان. إذا تم تصوير اليرقات باستخدام مجهر مقلوب ، بعد التصلب ، قم بقص الاغاروز الذي يحتوي على اليرقة إلى كتلة متوازية المستطيلات الصغيرة. لكشف الدماغ للتصوير ، قم بقص الأغروز الزائد فوق منطقة الدماغ التي تهم حسب الضرورة ، واستخدم إبرة زجاجية لعمل شق صغير عبر الجلد بالقرب من المنطقة التي تهمك ولكن ليس فوقها ، دون اختراق الأنسجة بعمق شديد.
بالكاد تحرك الإبرة تحت سطح الجلد مباشرة ، واستمر في إجراء جروح صغيرة جدا بعناية حول المنطقة محل الاهتمام حتى يمكن إزالة الجلد فوق المنطقة المعنية أو دفعه جانبا. عندما تتم إزالة الأنسجة من جميع الأجنة ، أضف قطرة صغيرة من الاغاروز منخفض الذوبان إلى غرفة التصوير المعدة مسبقا للمجهر المقلوب ، واستخدم ملعقة صغيرة لقلب كتلة الاغاروز متوازية المستطيلات 180 درجة على قطرة الاغاروز في غرفة التصوير. عندما يتجمد الاغاروز ، املأ غرفة التصوير ب ACSF الطازج وابدأ في تصوير اليرقة.