تصوير الخلايا باستخدام الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي

ابدأ بإعداد مجهر فلوري الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) مع غرفة تصوير مغطاة تحتوي على غطاء زجاجي مع خلايا الورم الأرومي العصبي البشري الملتصقة في مخزن مؤقت.

تعبر هذه الخلايا عن الفلوروفورات الخاصة بأغشية الحويصلة المتشابكة.

في وضع التألق العرضي ، حدد خلية للتصوير.

في وضع TIRF ، من خلال الهدف ، قم بتوجيه الليزر إلى العينة ، ويظهر كبقعة على الغلاف.

اضبط الزاوية لتتجاوز الزاوية الحرجة عند الواجهة بين الغطاء الزجاجي عالي معامل الانكسار وعينة معامل الانكسار المنخفض، مما يتسبب في حدوث انعكاس داخلي كلي (TIR)، ينظر إليه على أنه خط رفيع.

يولد TIR موجة زائلة تثير الفلوروفورات على أقرب غشاء.

يتم جمع التألق المنبعث من الهدف ويتم التقاطها بواسطة الكاميرا.

قم بضبط صورة عالية التباين لغشاء الخلية بالقرب من الغطاء.

قم بتحسين إعدادات الاستحواذ لتقليل التبييض الضوئي وضبط تردد أخذ العينات.

ابدأ تصوير TIRF لتصور الحويصلات المشبكية المنصهرة.

في وضع التألق ، ركز على الغطاء ، واختر الخلايا المنقولة الموضوعة في مركز الغرفة. تحت التحكم في البرنامج ، قم بالتبديل إلى إضاءة العشب في الوضع المباشر. لضبط تكوين العشب ، تحقق من موضع الشعاع الذي يخرج من الهدف على غطاء العينة. عندما يتم وضع الشعاع في وسط العدسة الشيئية ، تظهر بقعة في وسط غطاء عينة العشب ، ويتم تصوير الخلية في وضع التألق.

للوصول إلى الزاوية الحرجة ، حرك البقعة المركزة في الاتجاه Y باستخدام برغي ضبط الزاوية الموجود على شريط تمرير العشب. عندما يتقارب الشعاع على مستوى العينة بزاوية أكبر من الزاوية الحرجة ، تختفي البقعة ويظهر خط مستقيم ورفيع ومركز في منتصف غطاء العينة. لضبط زاوية العشب ، استخدم عينة خلية.

شاهد صورة التألق على الفيديو. في هذه المرحلة ، لا تزال الصورة الشبيهة بالتألق مرئية. حرك المسمار برفق حتى يتم تحقيق حالة العشب. هنا ، يتم التركيز على مستوى بصري واحد فقط من الخلية ، مما ينتج عنه صورة مسطحة ذات تباين عالي.

لإجراء تصوير عينة، قم بتعيين تجربة الفاصل الزمني أحادي القناة. تتراوح أوقات التعرض المناسبة بين 40 و 80 مللي ثانية. الحصول على صور بتردد أخذ العينات 1 أو 2 هرتز.