الحقن المجهري التجسيمي لناقل فيروسي للتلاعب الجيني في جرو الفأر المخطط

خذ جرو فأر معدل وراثيا يحمل كاسيت STOP محاط ب loxP يمنع بروتين الفلورسنت الأحمر أو تعبير RFP.

قم بتأمين الجرو على إطار تجسيمي مخصص وقم بتغطيته بالثلج للحفاظ على التخدير.

تطهير فروة الرأس ووضع علامة على لامدا كنقطة مرجعية.

قم بمحاذاة إبرة الحقن مع الإحداثيات المخططة بالنسبة إلى لامدا وثقب الجمجمة.

اسحب الإبرة إلى سطح الجمجمة ، ثم أدخلها في العمق المستهدف.

حقن الناقل الفيروسي المختلط بالصبغة في المخطط بمعدل متحكم فيه. يقوم المتجه بتشفير البروتينات الفلورية الخضراء أو GFPs و Cre recombinase.

اسحب الإبرة ببطء لمنع ارتجاع المحلول.

قم بإزالة الجرو والسماح بالتعافي.

في الخلايا المخططة ، يطلق الفيروس جينومه ، مما يتيح التعبير عن Cre recombinase و GFP. يقوم Cre باستئصال كاسيت STOP المحاط ب loxP، مما يؤدي إلى تنشيط تعبير RFP.

يؤكد

التعبير المتزامن ل GFP و RFP نجاح التلاعب الجيني.

ضع الجرو مع القفاز في صينية الرأس وضع بعض الثلج المجروش حول غلاف اللاتكس للحفاظ على تخدير انخفاض حرارة الجسم. ثم افرك رأس الجرو بنسبة 70٪ من الإيثانول وحدد موقع معلم لامدا. ضع علامة عليها بعلامة. ثم صوب طرف الإبرة إلى لامدا واضبط الإحداثيات الجانبية الأمامية والخلفية والإنسية على الصفر.

بعد ذلك ، استشارة أطلس الدماغ ، انقل ذراع الحقن إلى الموقع المستهدف. على سبيل المثال ، يقع مخطط صغار P2 على بعد 2.4 ملم من لامدا ، و 1.0 ملم على جانبي خط الوسط ، و 1.7 ملم بطني. بعد ذلك ، حدد موضع الصبغة الخضراء السريعة على أنبوب PE10 باستخدام قلم. ثم ابدأ ببطء في اختراق الإبرة من خلال الجلد والجمجمة حتى يلامس طرف الإبرة سطح الجمجمة.

اضبط الإحداثيات البطنية الظهرية على صفر. ثم اخفض الإبرة ببطء إلى الموقع المستهدف. بمجرد الوصول إلى موضعه ، انتظر لمدة دقيقة واحدة للسماح للحمة بالعودة إلى شكلها الطبيعي. ثم قم بتشغيل برنامج الحقن المجهري بمعدل 100 نانولتر في الدقيقة. أثناء الحقن ، شاهد الصبغة الخضراء السريعة تتحرك في أنبوب PE.

من الأهمية بمكان اختراق الإبرة ببطء عبر الجلد والجمجمة حتى يلامس طرف الإبرة سطح الجمجمة. أثناء الحقن ، من الضروري مشاهدة صبغة Fast Green تتحرك في أنبوب PE.

بعد اكتمال الحقن ، انتظر دقيقة واحدة ثم ارفع الإبرة ببطء إلى نصف عمق DV المخترق. ثم انتظر 30 ثانية أخرى قبل الشروع في السحب البطيء للإبرة من رأس الجرو.

بعد الانتهاء من الحقن ، من المهم الانتظار دقيقة واحدة قبل رفع الإبرة ببطء إلى نصف عمق DV المخترق ، ثم الانتظار 30 ثانية أخرى قبل سحب الإبرة ببطء من رأس الجرو.

بعد حقن جميع المواقع المستهدفة ، قم بتسخين الجرو لمدة 20 دقيقة في حاضنة 33 درجة مئوية.

تحقق من الجرو كل خمس دقائق حتى يستعيد الاستلقاء القصي. ثم أعد الجرو إلى سده.