تركيز من الأيضات من المجتمعات العوالق منخفض الكثافة لالايض البيئية باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي

ويرد طريقة لاستخراج المستقلب من المجتمعات العوالق الجرثومية. ويتحقق كل مجتمع أخذ العينات عن طريق الترشيح على مرشحات أعدت خصيصا لذلك. بعد lyophilization، يتم استخراج مائي للذوبان في الأيضات. ويسمح هذا النهج لتطبيق الايض البيئية عبر omics التحقيقات في المجتمعات الميكروبية الطبيعية أو التجريبية.

يوفر التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي العديد من المزايا المميزة لأبحاث التمثيل الغذائي البيئي ، ولكنه غير حساس نسبيا في هذا الإجراء. تم الإبلاغ عن طريقة ترشيح لتركيز واستخلاص مستقلبات المجتمع بأكمله من الأنظمة الأفلاطونية المناسبة للرنين المغناطيسي النووي. يتم تحقيق ذلك من خلال إعداد المرشحات أولا خصيصا لجمع العينات عن طريق إزالة المواد القابلة للاستخراج.

الخطوة الثانية من الإجراء هي تصفية العينة ، سواء كانت طبيعية أو تجريبية على المرشحات. الخطوة الثالثة من الإجراء هي إضفاء الحيوية على مادة العينة واستخراج المستقلبات. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في تحليل العينات باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي ودمج البيانات حسب الاقتضاء.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تغيرات التمثيل الغذائي في العينات الطبيعية عبر التدرجات البيئية أو استجابة للتلاعب التجريبي من خلال أساليب التمثيل الغذائي والترانسام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل الطرد المركزي ، هي أنه يمكن أخذ عينات من المجتمع الكلي ويمكن استخدام أحجام عينات أكبر للعينات منخفضة الكثافة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال مزيج المعادن البيئية ، مثل كيفية استجابة النمو الجزئي للتغيرات البيئية ، وإظهار الإجراء سيكون المرحلة ومن مختبري.

ابدأ هذا البروتوكول بوضع المرشحات في مكبر صوت Pyrex نظيف سعة 500 مل باستخدام ملاقط. قم بتغطية الفلتر بالماء المقطر لشطف الدوران جيدا لمنع المرشحات من الالتصاق ببعضها البعض. اسكب الماء وكرر الشطف مرتين.

بعد الشطف النهائي ، أضف 300 مل من ماء Milli Q إلى الدورق وقم بتعقيم المرشحات. بمجرد تعقيم المرشحات. اسكب ماء ميلي كيو واشطف المرشحات ثلاث مرات كما كان من قبل باستثناء استخدام ماء ميلي كيو.

ضع المرشحات الفردية على سطح نظيف وجاف ، مثل رقائق الألومنيوم مع ملاقط جافة على درجة حرارة معقولة. على سبيل المثال ، عند 37 درجة أو تجف في الهواء ، أصبحت المرشحات جاهزة الآن للاستخدام لإظهار هذا البروتوكول. يتم استخدام مشعب مرشح من الفولاذ المقاوم للصدأ بثلاثة أماكن من الفولاذ المقاوم للصدأ بأعمدة ترشيح للتحليل المجهري 25 ملم مع دعامات زجاجية ومضخة ميكانيكية باستخدام تقنية معقمة.

ضع مرشحا واحدا مقاس 25 ملم على قاعدة عمود المرشح. ضع العمود وقم بتثبيت الجهاز معا. قم بتحميل 15 مل من العينة هنا التي تم الحصول عليها من عالم مصغر عالي المغذيات إلى العمود.

افتح صمام الإيقاف الموجود على مشعب الفلتر وقم بتشغيل مرشح المضخة تحت ضغط لطيف لتقليل كسر الخلايا. بالنسبة للعينات منخفضة الكثافة ، قد تكون الإضافات المتتالية للمياه ضرورية. مع الحرص على عدم ترك الفلتر يجف لفترة طويلة من الوقت بين إضافات الماء.

ثانيا ، تقليل الأملاح المغناطيسية المتبقية من العينات البحرية ويمكن إجراء شطف اختياري بالمياه العذبة. بمجرد الانتهاء من التصفية ، قم بإيقاف تشغيل المضخة واترك الصمام مفتوحا حتى لا يزال هناك ضغط سلبي تحت الفلتر. قم بإزالة المشبك وعمود المرشح بيد واحدة.

استخدم ملاقط نظيفة للإمساك بالفلتر. قم بطي الفلتر عبر نفسه ولكن لا تتجعد باليد الأخرى. استخدم شفة أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة ملليلترين لتثبيت الفلتر لأسفل.

ضع الفلتر في أنبوب المليلتر وحرره بحيث يفتح مع توجيه جانب العينة إلى الداخل. قم بتجميد النيتروجين السائل على الفور لاستخراج المستقلبات المائية القابلة للذوبان. قم أولا بتنشيط العينات طوال الليل أو لمدة 10 ساعات على الأقل بعد التجميد ، أضف كسارة من الفولاذ المقاوم للصدأ إلى كل أنبوب رفيع.

أضف 750 ميكرولتر من محلول فوسفات البوتاسيوم القياسي وأكسيد الديوتيريوم بمعيار DSS. صوتنة العينات لمدة خمس دقائق عند أربع درجات في سونيكات الماء لإزالة مادة الخلية من الفلتر. قم بإزالة المرشحات بملاقط نظيفة.

قم بتعطيل الخلايا باستخدام كسارة مطحنة بسرعة 1600 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، احتضن عند 65 درجة مئوية. كان يرتجف على شاكر على مقاعد البدلاء لمدة 15 دقيقة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الكسارة المعدنية بملاقط نظيفة. الطرد المركزي العينة عند 13 ، 000 جم لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، اسحب SUP natin ونقله مباشرة إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي للتحليل الطيفي NM r.

قم بتحميل العينة في مطياف الرنين المغناطيسي النووي هنا. يتم تشغيل العينات على مطياف Bruker DRX 500 المجهز بمسبار TXI مع تدرج ثلاثي المحاور يعمل عند 298 كلفن. قفل المغناطيس وضبطه وتثبيته.

احصل على 1D proton NMR Spectra باستخدام واجهة الدوران العلوية والطرق الموصوفة سابقا أو استخدم برامج واجهة مطياف أخرى حسب الحاجة. هنا تم الحصول على الأطياف مع قمع إشارات الماء المتبقية بواسطة تسلسل نبض ووترغيت مع وقت تكرار يبلغ 1.2 ثانية. في المثال الحالي ، تم جمع 128 عابرا لكل عينة.

انقل دلائل بيانات الرنين المغناطيسي النووي إلى جهاز كمبيوتر شخصي مثبت عليه برنامج أنابيب الرنين المغناطيسي النووي. قم بمعالجة البيانات الأولية ، وقم بتعيين إشارة DSS كمرجع صفر جزء في المليون ، ثم قم بتقسيم الأطياف يدويا. قم برقمنة البيانات الطيفية عن طريق bin هنا باستخدام حزمة FT two B المتاحة للجمهور من موقع التجارة الإلكترونية.

يمكن أيضا استخدام أدوات البرامج الأخرى مثل RNMR أو Atomics للسلة. بن. يمكن تطبيع البيانات إلى إشارة إجمالية أو DSS لإظهار تغيرات الإشارة النسبية بين العينات. يمكن الآن استخدام بيانات الإخراج للتحليل الإحصائي النهائي ، مثل تحليل المكونات الأساسية أو PCA باستخدام حزم البرمجيات الحرة مثل R الموضحة.

فيما يلي مثال على البروتون NMR Spectra الذي تم الحصول عليه باستخدام الإجراء المظهر. الأطياف من نقطتين زمنيتين لتجربة عالم مصغر وتظهر اختلافات واضحة بسبب أنشطة التمثيل الغذائي للطحالب. يظهر طيف اليوم الرابع وفرة كبيرة من القمم ، لا سيما في النطاق من الساعة الثالثة إلى 4:00 مساء مقارنة بعينة اليوم الأول.

يمكن أن تعزى هذه القمم إلى السكريات التي تنتجها الدياتومات المزهرة داخل العالم المصغر. في تجربة مماثلة ، تم استخدام مخطط درجة PCA مشتق من الانحناء في Mr.Spectra يوضح المكونين الأساسيين الأولين لمقارنة نمو مجتمعات العوالق الطبيعية في مياه البحر الاصطناعية والطبيعية. يقلل هذا النهج الإحصائي من البيانات متعددة الأبعاد إلى تنسيق أبسط هنا ، ثنائي الأبعاد ويكشف ببساطة عن الهيكل في نقاط البيانات الأساسية القريبة.

كل محور أو كلاهما أكثر تشابها هنا. يمكن رؤية الاختلافات الأيضية الواضحة بين العلاجين. تم استخدام البيانات من هذه التجربة لإجراء تحليل أوميكس.

يظهر الجمع بين الرنين المغناطيسي النووي وتكوين مجتمع البيانات الجينومية القائم على تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي للهلام المتدرج ل 18 ثانية و 16 جينا من جينات S-R-R-N-A أنماطا مجتمعية ميكروبية مميزة بين العوالم المصغرة الطبيعية والاصطناعية لمياه البحر. توضح هذه المراسلات بين الأيض والجينوم من الأنظمة الطبيعية فائدة هذا النهج. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام تقنية موضوعية لتقليل التلوث باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل الإنشاء بمستويات omics من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية ارتباط الميكروبيوم بمستقلبات معينة.