تركيز من الأيضات من المجتمعات العوالق منخفض الكثافة لالايض البيئية باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي

يوفر مطياف الرنين المغناطيسي النووي العديد من المزايا المتميزة لأبحاث الميتابولوميات البيئية، ولكنه يتسم بحساسية منخفضة نسبياً في هذا الإجراء. يتم هنا عرض طريقة ترشيح لتركيز واستخلاص الميتابوليتات من المجتمعات الكاملة في الأنظمة البلاكتونية بحيث تكون مناسبة للرنين المغناطيسي النووي. يتم تحقيق ذلك من خلال تحضير مرشحات مخصصة لجمع العينات أولاً عن طريق إزالة المواد القابلة للاستخلاص.

تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في ترشيح العينة، سواء كانت طبيعية أو تجريبية، على المرشحات. والخطوة الثالثة من الإجراء هي تجميد وتجفيف مادة العينة واستخلاص المستقلبات. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تحليل العينات باستخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي ودمج البيانات حسب الاقتضاء.

وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر التغيرات الأيضية في العينات الطبيعية عبر التدرجات البيئية أو استجابةً للتلاعبات التجريبية من خلال نهجي الميتابولوميات (metabolomics) والترانزوميات (transams). وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الطرد المركزي، في إمكانية أخذ عينات من المجتمع الحيوي بأكمله، وإمكانية استخدام أحجام عينات أكبر للعينات ذات الكثافة المنخفضة. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال خليط المعادن البيئية، مثل كيفية استجابة النمو الميكروبي للتغيرات البيئية. سيتم عرض الإجراء من خلال مراحل من مختبري.

ابدأ هذا البروتوكول بوضع المرشحات في وعاء Pyrex نظيف سعة 500 milliliter باستخدام الملاقط. غطِّ المرشح بالماء المقطر للشطف المسبق مع التحريك بشكل دائري جيداً لمنع التصاق المرشحات ببعضها البعض. صب الماء وكرر عملية الشطف مرتين.

بعد عملية الشطف النهائية، أضف 300 milliliters من Milli Q water إلى الكأس وقم بتعقيم المرشحات باستخدام الموصدة (autoclave). وبمجرد تعقيم المرشحات، قم بتصريف Milli Q water واشطف المرشحات ثلاث مرات كما سبق، باستثناء استخدام Milli Q Water.

ضع المرشحات الفردية على سطح نظيف وجاف، مثل رقاقة ألومنيوم، باستخدام ملاقط، ثم جففها في درجة حرارة مناسبة. على سبيل المثال، عند 37 درجة أو بالتجفيف الهوائي، وتصبح المرشحات الآن جاهزة للاستخدام في تطبيق هذا البروتوكول. يُستخدم مشعب ترشيح من الفولاذ المقاوم للصدأ من نوع Millipore يحتوي على ثلاثة أماكن، ومجهز بأعمدة ترشيح للتحليل الدقيق بقطر 25 مليمتر مع دعامات زجاجية ومضخة ميكانيكية، وذلك مع اتباع التقنيات التعقيمية.

ضع مرشحاً واحداً بقطر 25 مليمتر على قاعدة عمود الترشيح. قم بتركيب العمود وتثبيت الجهاز معاً بواسطة المشبك. قم بتحميل 15 مليلتر من العينة التي تم الحصول عليها من نموذج بيئي مصغر عالي المغذيات في العمود.

افتح صمام الإيقاف في مجمع المرشح وشغل مضخة الترشيح تحت ضغط خفيف لتقليل تكسر الخلايا. بالنسبة للعينات ذات الكثافة المنخفضة، قد يكون من الضروري إضافة الماء على دفعات متتالية، مع الحرص على عدم ترك المرشح يجف لفترة زمنية طويلة بين إضافات الماء.

ثانياً، يمكن تقليل الأملاح البارامغناطيسية المتبقية من العينات البحرية وإجراء شطف اختياري بالماء العذب. بمجرد الانتهاء من عملية الترشيح، أوقف تشغيل المضخة واترك الصمام مفتوحاً للحفاظ على الضغط السلبي تحت المرشح. قم بإزالة المشبك وعمود الترشيح بيد واحدة.

استخدم ملقطًا نظيفًا للإمساك بالمرشح. اطبِ المرشح على نفسه ولكن تجنب ثنيه باليد الأخرى. استخدم حافة أنبوبة طرد مركزي دقيقة معقمة سعة 2 mL لتثبيت المرشح في مكانه.

ضع المرشح في أنبوب سعة 2 mL واتركه ليفتح بحيث يكون جانب العينة موجهاً نحو الداخل. جمد العينة في النيتروجين السائل فوراً لاستخلاص المستقلبات الذائبة المائية. أولاً، قم بإعادة ترطيب العينات طوال الليل أو لمدة 10 ساعات على الأقل بعد التجفيف بالتجميد، ثم أضف سحقاً من الفولاذ المقاوم للصدأ إلى كل أنبوب.

أضف 750 µL من منظم فوسفات البوتاسيوم القياسي وأكسيد الدوتيريوم مع معيار DSS. قم بمعالجة العينات بالموجات فوق الصوتية لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C في حمام مائي للموجات فوق الصوتية لإزالة المواد الخلوية من المرشح. انزع المرشحات باستخدام ملاقط نظيفة.

قم بتفتيت الخلايا باستخدام مطحنة كروية بسرعة 1600 RPM لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بالتحضين عند 65 درجة Celsius. مع الرج على جهاز رج مكتبي لمدة 15 دقيقة.

بعد انتهاء فترة الحضن، قم بإزالة الساحقة المعدنية باستخدام ملاقط نظيفة. قم بطرد العينة مركزياً عند 13,000 G لمدة خمس دقائق. بعد عملية الطرد المركزي، اسحب الراشح وانقله مباشرة إلى أنبوب NMR لإجراء تحليل NMR spectroscopy.

قم بتحميل العينة في مطياف NMR هنا. يتم تشغيل العينات على مطياف Bruker DRX 500 مجهز بمسبار TXI مع تدرج ثلاثي المحاور يعمل عند 298 Kelvin. قم بضبط القفل والضبط (tune) والتحسين (shim) للمغناطيس.

يتم الحصول على أطياف الرنين المغناطيسي النووي البروتوني أحادي البعد (1D proton NMR) باستخدام واجهة TopSpin والطرق الموصوفة سابقاً، أو استخدام برامج واجهة أجهزة قياس الطيف الأخرى حسب الحاجة. وفي هذه التجربة، تم الحصول على الأطياف مع تثبيط إشارات الماء المتبقية باستخدام تتابع نبضات Watergate بزمن تكرار قدره 1.2 ثانية. وفي المثال الحالي، تم جمع 128 مسحاً (transients) لكل عينة.

انقل أدلة بيانات NMR إلى جهاز كمبيوتر شخصي مثبت عليه برنامج NMR pipe. قم بمعالجة البيانات الخام، واضبط إشارة DSS كمرجع لـ zero PPM، ثم قم بعمل مرحلة (phase) للأطياف يدوياً. قم برقمنة البيانات الطيفية عن طريق التجزئة (binning) هنا باستخدام حزمة FT two B المتاحة للعموم من الموقع الإلكتروني للتجارة الإلكترونية.

يمكن أيضاً استخدام برامج مساعدة أخرى مثل RNMR أو Atomics لعملية bin.Bin. ويمكن تطبيع البيانات (normalization) بالنسبة لإجمالي الإشارة أو إشارة DSS لإظهار التغيرات النسبية في الإشارة بين العينات. ويمكن الآن استخدام البيانات الناتجة في التحليلات الإحصائية اللاحقة، مثل تحليل المكونات الرئيسية أو PCA باستخدام حزم البرمجيات المجانية مثل R الموضحة.

فيما يلي مثال على أطياف الرنين المغناطيسي النووي للبروتون (proton NMR Spectra) التي تم الحصول عليها باستخدام الإجراء الموضح. تعود هذه الأطياف إلى نقطتين زمنيتين من تجربة نموذج بيئي مصغر (microcosm experiment)، وتظهر اختلافات واضحة ناتجة عن الأنشطة الأيضية للطحالب. يظهر طيف اليوم الرابع وفرة كبيرة في القمم، لا سيما في النطاق ما بين 3 إلى 4:00 مساءً مقارنة بعينة اليوم الأول.

يمكن إرجاع هذه القمم إلى السكريات التي تنتجها الدياتومات المزهرة داخل النموذج المصغر. وفي تجربة مماثلة، استُخدم مخطط درجات PCA المستمد من برنامج Mr.Spectra، والذي يوضح المكونين الرئيسيين الأولين، لمقارنة نمو مجتمعات العوالق الطبيعية في مياه البحر الاصطناعية والطبيعية. يعمل هذا النهج الإحصائي على تقليل البيانات متعددة الأبعاد إلى تنسيق أبسط، وهو هنا ثنائي الأبعاد، ويكشف ببساطة عن البنية في نقاط البيانات الأساسية المتقاربة.

يبدو كلا المحورين أو أحدهما أكثر تشابهاً هنا. ويمكن ملاحظة فروق أيضية واضحة بين المعاملتين. وقد استُخدمت البيانات الناتجة عن هذه التجربة لإجراء تحليل أوميكس متعدد.

يُظهر الجمع بين الرنين المغناطيسي النووي (NMR) وبيانات التركيب المجتمعي الجينومي المستندة إلى الفصل الكهربائي للهلام ذو التدرج المسخ لجينات 18 s و 16 S-R-R-N-A أنماطاً متميزة للمجتمعات الميكروبية بين النماذج المصغرة لمياه البحر الطبيعية والاصطناعية. ويوضح هذا التوافق بين الميتابولوم والجينوم في الأنظمة الطبيعية مدى فائدة هذا النهج. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام تقنية مناسبة لتقليل التلوث بعد اتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى، مثل تحليل الارتباط على مستويات الأوميكس، للإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية ارتباط الميكروبيوم بمستقلبات معينة.