توصيل الجينات تحت الظهر في الحبل الشوكي للفأر لتقييم التعبير الجيني

خذ فأرا مخدرا واحلق ظهره وقم بتطهير الجلد.

شق الجلد ، وفصل العضلات عن الفقرات ، وسحبها باستخدام المشابك.

احفر في الصفيحة الفقرية لإحداث تشققات ، ثم قم بإزالة شظايا العظام لكشف الأم الجافية ، غشاء الحبل الشوكي الخارجي.

باستخدام إبرة ، قم بإنشاء فتحة جافية وثقب الأم الأساسية لدخول المساحة السفلية للوصول المباشر إلى أنسجة العمود الفقري.

خذ إبرة توصيل تحتوي على معلق من الفيروس المؤتلف المرتبط بالغدة يحمل جينا يعبر عن البروتين الفلوري وحقن المعلق.

اسحب الإبرة ، وخياطة العضلات والجلد ، واسمح للفأر بالتعافي.

يرتبط الفيروس بالمستقبلات الموجودة على الخلايا العصبية والخلايا الدبقية ويتم خلطته الخلوية.

بمجرد دخوله إلى النواة ، يحفز الفيروس التعبير الجيني لإنتاج بروتينات الفلورسنت.

نموذج توصيل الجينات تحت الظهر جاهز الآن لتقييم التعبير الجيني المستهدف في الحبل الشوكي.

ابدأ بتخدير بشكل صحيح لإجراء الجراحة. يستخدم إيزوفلوران هنا. تأكد من عدم وجود استجابة قرصة مخلب قبل المتابعة. ثم غطي العينين بمرهم للعيون. بعد ذلك ، احلق ظهر باستخدام المقصات ، ونظف الجلد باستخدام 2٪ كلورهيكسيدين.

إذا كان سيتم إجراء الحقن تحت الظهر القطني ، فقم بقص الجلد الذي يغطي الفقرات T8 إلى L1 بمشرط. ثم استخدم المقص لفصل العضلة الفقرية من الفقرات الشوكية T10 إلى T12. قم بتركيب في إطار تجسيمي قياسي باستخدام مشابك العمود الفقري للفأر. بعد ذلك ، استخدم مثقاب الأسنان لحلق جانبي الصفيحة من الفقرات T10 إلى T12 حتى تظهر الشقوق.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لإزالة شظايا العظام المتشققة وفضح السطح الظهري للحبل الشوكي القطني. الجافية مرئية الآن. استخدم إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ قياس 30 لعمل شق من 1 إلى 2 ملم في الجافية.

من المهم قطع الجافية بعناية لتجنب إصابة غشاء البي الأساسي.

الآن ، أمسك حافة الجافية المقطوعة بالملقط وقم بتمديد فتحة الجافية حتى 5 ملليمترات. قم بتركيب إبرة اختراق قياس 34 وإبرة حقن قياس 36 على أذرع Z لاثنين من معالجي XYZ منفصلين باستخدام حاملات شعرية زجاجية.

بعد ذلك ، استخدم حقنة صغيرة سعة 50 ميكرولتر متصلة بأنابيب PE-10 أو PE-20 لتحميل فيروس AAV9-UBI-GFP. بعد تحميل الفيروس ، قم بتوصيل نهاية الأنبوب بإبرة الحقن. بعد ذلك ، أثناء النظر من خلال نطاق تشريح جراحي تم ضبطه على تكبير من 8 إلى 10x ، استخدم الذراع X لخفض إبرة اختراق pia إلى عمق 1 ملليمتر. حافظ على زاوية الإبرة المخترقة من 5 إلى 10 درجات ، بالنسبة لسطح الأنسجة.

بعد فتح pia ، استخدم الذراع X لإزالة إبرة اختراق pia من المساحة السفلية. لاحظ الموقع المخترق باستخدام معلم ، مثل الأوعية الدموية. حرك أذرع X وY وZ للمناور الثاني لوضع طرف إبرة الحقن المحملة بفيروس AAV9 في الموقع المخترق بواسطة pia.

بعد ذلك ، بعد إدخال طرف إبرة الحقن حوالي 0.5 ملم في الفضاء تحت السطح ، استخدم ذراع Z لرفع pia حوالي 0.3 ملم ، ثم استخدم الذراع X لمواصلة تقدم الإبرة أفقيا إلى الفضاء الفرعي. تقدم الإبرة حتى تدخل المساحة السفلية على عمق حوالي 2 إلى 3 ملليمترات.

بعد ذلك ، استخدم المحقنة الدقيقة سعة 50 ميكرولتر لحقن فيروس AAV9-UBI-GFP في المساحة السفلية. قم بإزالة إبرة الحقن من المساحة السفلية بعد اكتمال حقن AAV9-UBI-GFP. أغلق العضلات والجلد باستخدام خياطة الشعيرات الأحادية الفلورية والمشابك الجراحية. اسمح للحيوان بالتعافي على وسادة تدفئة قبل وضعه في قفص نظيف.