تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور
July 9th, 2011
الاستفادة من التقدم في مجال التنمية وfluorophore تكنولوجيا التصوير ، وهي طريقة بسيطة لوضع العلامات اليكسا فلور من حمى الضنك ولقد ابتكر الفيروس لتصور التفاعلات المبكرة بين الفيروس والخلية.
الهدف العام من هذه التجربة هو تسمية فيروس حمى الضنك بالفلورسنت للدراسات المجهرية. قم بإعداد المخازن المؤقتة اللازمة وتنقية فيروس حمى الضنك باستخدام وسادة السكروز لإعادة تشكيل صبغة تدفق Amy React Alexa وفيروس حمى الضنك في المخزن المؤقت لوضع العلامات. قم بتسمية فيروس حمى الضنك بمائة ميكرومولار من تدفق Alexa.
يموت لمدة ساعة واحدة ويتوقف عن تفاعل وضع العلامات باستخدام الكاشف الفرعي. تنقية فيروس حمى الضنك من خلال عمود استبعاد الحجم. قم بإعادة الفيروس المسمى عن طريق فحص البلاك وتقدير درجة الملصقات عن طريق مقايسة التألق المناعي.
مرحبا ، أنا سام جانغ من مختبرات DSO الوطنية أعمل في مختبر الدكتور وي في برنامج الأمراض المعدية الناشئة بعد تخريج كلية الطب في جامعة نورثونا. سأوضح لك اليوم كيفية تصنيف فيروس Denki بالفلورسنت باستخدام صبغة إنفلونزا Amy Reactive Alexa لدراسات التصوير. أليكسا ، تموت الأنفلونزا ، متفوقة على الاستقرار وأقل حساسية لدرجة الحموضة من النظام الغذائي الشائع مثل الفلورسين ومهمة الكرش ، مما يجعلها مثالية للدراسات حول الامتصاص الخلوي والنقل الداخلي للفيروس.
سيسهل عيب Alexa المسمى فيروس حمى الضنك فهم التسبب في حمى الضنك. لذلك دعونا نبدأ. قبل تفاعل وضع العلامات ، قم بإعداد مخزن مؤقت جديد لوضع العلامات وإيقاف الكاشف وفقا للبروتوكول المكتوب وتنقية فيروس حمى الضنك بواسطة وسادة السكروز ، وأضف الحجم المناسب من فيروس حمى الضنك المنقى إلى مخزن مؤقت الملصقات في أنبوب الطرد المركزي الصغير لتحقيق تركيز 300 مليون وحدة تشكيل لكل مليلتر.
يمكن توسيع نطاق هذا بشكل متناسب. لوضع العلامات على دفعات الفيروسات. أعد تكوين صبغة أرضية Alexa المجففة بالتجميد إلى مللي مولار واحد في مخزن الملصقات قبل تفاعل وضع العلامات مباشرة.
قلل من التعرض للضوء من هذه الخطوة فصاعدا. لغرض العرض التوضيحي ، سيتم ترك صبغة أرضية Alexa دون حماية من الضوء 800 ميكرولتر من المليمولية الواحدة. يموت تدفق Alexa إلى فيروس حمى الضنك المخفف أثناء التقليب برفق باستخدام طرف الماصة الدقيقة.
احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء الممزوج بالانعكاسات اللطيفة كل 15 دقيقة بعد ساعة واحدة ، والطرد المركزي للأنابيب لفترة وجيزة. 800 ميكرولتر من المنطقة الفرعية أثناء التحديق برفق باستخدام الماصة الدقيقة تحتضن لمدة ساعة إضافية في درجة حرارة الغرفة. محمي من الضوء عن طريق انعكاسات لطيفة كل 15 دقيقة.
في غضون ذلك ، فإنه يساوي عمود التنقية ب 25 مل من المخزن المؤقت HNE. بعد حضانة ساعة واحدة ، قم بتطبيق الفيروس المسمى على العمود وابدأ في جمع التدفق من خلال. املأ العمود بمخزن مؤقت HNE.
بمجرد دخول كل الفيروس المسمى إلى المصفوفة ، تخلص من أول 2.5 مل من التدفق واجمع المليلترين التاليين من جزء الفيروس المسمى. Ecor وشاهد الفيروس المنقى المسمى عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. تحديد عنوان الفيروس المسمى عن طريق فحص البلاك.
في تجربة نموذجية ، يجب ملاحظة انخفاض أقل من عشرة أضعاف في عنوان الفيروس. بعد وضع العلامات ، يجب إجراء مقايسة التألق المناعي لتقييم درجة وضع العلامات. للقيام بذلك ، قم بتعداد الخلايا الفيروسية باستخدام مقياس الخلوي الدموي والحجم المناسب للخلايا لوسائط النمو لتحقيق كثافة 50 ، 000 خلية لكل مليلتر.
انظر مليلتر واحد من الخلايا الفيروسية لكل بئر في صفيحة رباعية الآبار تحتوي على غطاء زجاجي معقم. نوم. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وشفط المستلق من البئر في الواقع ، الخلايا التي تحتوي على ما يقرب من وزارة داخلية واحدة من الفيروس المسمى في حجم مائة ميكرولتر لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
قم بإزالة اللقاح واغسل الخلايا ب 0.5 مل من المخزن المؤقت PBS لكل بئر. روح dis وكرر هذا الإجراء مرتين أخريين. قم بإصلاح الخلايا ب 200 ميكرولتر من 3٪ لكل ارتفاع متعدد لكل بئر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 0.5 مل من المخزن المؤقت PBS لكل بئر. قم بإزالة الخلايا بمحلول التزجيم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة غطاء السكون جيدا باستخدام ملقط دقيق.
قم بتصريف السوائل الزائدة عن طريق وضع حافة الغطاء. انزلق على ورقة بيضاء. ضع جانب الخلية من الغطاء.
نم على 25 ميكرولتر من الجسم المضاد لبروتين حمى الضنك على قطعة من العطر. احتضن لمدة ساعة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. بعد ذلك ، انقل زلة الغطاء إلى صفيحة بستة آبار وأضف ملليلترين من محلول الغسيل لكل زيت.
استنشق الاستلقاء. كرر خطوات الغسيل هذه مرتين أخريين بعد آخر غسلة. قم بإزالة زلة الغطاء من البئر باستخدام fp ناعم.
صفي السوائل الزائدة عن طريق غمس حافة الغطاء. انزلق على مناديل ورقية. ضع جانب الخلية من الغطاء.
نم على 25 ميكرولترا من أرضية Alexa لثمانية أجسام مضادة ثانوية مضادة للفأر على قطعة عطر. احتضن لمدة 45 دقيقة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء بعد اكتمال الحضانة ، انقل الغطاء إلى لوحة ستة آبار واغسل الخلايا ثلاث مرات بملليلترين من محلول الغسيل لكل غسلة بعد الغسيل الأخير. قم بإزالة زلة الغطاء من البئر واشطفها مرة واحدة في الماء المؤين.
صفي السوائل الزائدة عن طريق غمسها على الورق. امسح زلة الغطاء على ضوء المجهر بثمانية ميكرولترات من محلول التثبيت المعتدل. اسمح لمحلول التركيب بضبط الهواء طوال الليل أربع درجات مئوية.
العينة جاهزة الآن للتصور باستخدام مجهر فلوري أو متحد البؤر. ضع قطرة صغيرة من زيت الغمر على سطح الغطاء وقم بربط المجهر. انزلق إلى مرحلة المجهر.
اضبط المرحلة حتى يتلامس هدف المجهر مع زيت الغمر. للحصول على صورة كلارالية ، أطفئ الأضواء المحيطة باستخدام برنامج Zes Zen. انقر فوق الصنبور العيني للمراقبة المباشرة للعينة من خلال عدسة المجهر.
ابحث عن تعبئة بالخلايا واضبط التركيز. الآن قم بالتبديل إلى وضع الاستحواذ. لتقليل الحديث المتبادل بين سقوط الأزهار ، حدد مسارات منفصلة لطابق Alexa 4 8 8 وأربعة محدودة.
الأصباغ ومجموعة المقتنيات للإثارة والكشف المتسلسلة. اضبط كسب طاقة الليزر وإزاحة الليزر للتأكد من أن الصورة ليست مكشوفة أكثر أو أقل. التقط الصورة وحلل مجال الاهتمام باستخدام وظيفة التحديد المشترك.
يمكن استخدام معامل التداخل لتقدير درجة وضع العلامات على فيروس حمى الضنك بواسطة صبغة Alexa Flo. تم إجراء اختبار بسيط للتألق المناعي على الخلايا الفيروسية ويمكن تقدير درجة الملصقات من التموضع المشترك للفيروس المسمى مع البروتين المضاد لل e ، يتراوح تداخل تداخل تلطيخ الأجسام المضادة من 0.65 إلى 0.8 مما يشير إلى أن ما يقرب من 65 إلى 80٪ من الاختلافات تم تصنيفها بصبغة أرضية Alexa. لكي يكون إجراء وضع العلامات ناجحا ، من المهم إعداد المخزن المؤقت لوضع العلامات والبدء في الاحتدام الطازج وإعادة تشكيل ملخص أرضية Alexa قبل وضع العلامات.
يمكن تحسين تركيز الصبغة المراد استخدامها لتناسب احتياجاتك. يمكن تكييف هذه الطريقة لتصنيف فيروس حمى الضنك في الأفق لتسمية فيروسات أخرى. هذا كل شيء.
شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجربة وضع العلامات الخاصة بك.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لوضع علامات فلورية على فيروس حمى الضنك باستخدام Alexa Fluor لتحليله تحت المجهر. تتيح النهج تصوير التفاعلات المبكرة بين الفيروس وخلايا المضيف.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الفيروسات
- المجهر الفلوري
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- فيروس حمى الضنك يشكل مصدر قلق صحي عالمي كبير.
- فهم تفاعلات الفيروس والخلية أمر بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات مضادة للفيروسات.
- تعزز العلامات الفلورية من تصوير هذه التفاعلات.
- تسهل التطورات في تقنيات التصوير إجراء دراسات مفصلة.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة موثوقة لوضع علامات على فيروس حمى الضنك.
- لتصوير التفاعلات بين فيروس حمى الضنك وخلايا المضيف.
- لتحسين فهم المراحل المبكرة للعدوى الفيروسية.
الطرق المستخدمة
- تحضير المحاليل العازلة اللازمة لوضع العلامات.
- تنقية فيروس حمى الضنك باستخدام وسادة السكروز.
- إعادة تكوين صبغة Alexa Fluor في محلول وضع العلامات.
- وضع علامة على الفيروس بتركيز محدد من الصبغة.
النتائج الرئيسية
- نجاح وضع العلامات الفلورية على فيروس حمى الضنك.
- تصوير التفاعلات بين الفيروس والخلية تحت المجهر.
- تقييم كفاءة وضع العلامات من خلال فحص المناعة الفلورية.
- إعادة تقدير الفيروس المسمى باستخدام فحص البلاك.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة طريقة بسيطة وفعالة لوضع علامات على فيروس حمى الضنك.
- يساعد وضع العلامات الفلورية في دراسة تفاعلات الفيروس مع المضيف.
- يمكن تطبيق هذه التقنية على دراسات فيروسية أخرى.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Direct fluorescent labeling of dengue virus with Alexa Fluor enables precise visualization of virus-cell interactions, supporting early-stage mechanistic studies in infectious disease research. This capability enhances predictive confidence in target validation and informs translational strategies for antiviral and vaccine development. The method's compatibility with live virus and quantitative imaging strengthens its value across discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of virus entry and trafficking mechanisms in host cells.
- Supports biological de-risking by clarifying early infection events relevant to pathogenesis.
- Facilitates functional target validation through visualization of labeled virus interactions.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized approach for preparing fluorescently labeled virus for imaging-based assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of labeling efficiency via immunofluorescence and plaque assays.
- Enables scalable batch labeling suitable for high-content screening platforms.
- Supports reliable evaluation of antiviral compound effects on virus-cell entry and trafficking.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by preserving virus infectivity post-labeling.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of intervention strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative imaging readouts.
- Facilitates biomarker alignment through colocalization analysis of viral and cellular markers.
Pipeline & Workflow Integration
This labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis-driven studies, assay development, and translational research on viral pathogenesis.
- Discovery Biology: Advances mechanistic understanding of virus-host interactions through direct visualization and quantitative colocalization.
- Screening: Delivers reproducible, labeled virus preparations for imaging-based screening of antiviral candidates.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as overlap coefficients and infectivity titers for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains functional virus for use in disease-relevant cellular models and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable protocol for labeling other enveloped viruses in diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage virology research.
- Operational Value: Standardizes virus labeling and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral and vaccine candidates based on quantitative imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to high-quality imaging platforms and analytical software for colocalization studies.
- Demands rigorous buffer preparation and dye handling to ensure reproducibility and minimize cytotoxicity.
- Adaptable to other enveloped viruses with protocol optimization for specific viral systems.
- Dependent on maintaining virus viability and labeling efficiency for downstream applications.
