تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

الهدف العام من هذه التجربة هو وسم فيروس حمى الضنك فلوريًا للدراسات المجهرية. قم بتحضير المحاليل المنظمة اللازمة وتنقية فيروس حمى الضنك باستخدام وسادة السكروز، ثم أعد تكوين صبغة Amy React Alexa flow وفيروس حمى الضنك في محلول الوسم المنظم. قم بوسم فيروس حمى الضنك بتركيز 100 µM من Alexa flow.

اتركه لمدة ساعة واحدة ثم أوقف تفاعل الوسم باستخدام كاشف الإيقاف. قم بتنقية فيروس dengue المَوْسَم عبر عمود استبعاد الحجم. أعد معايرة الفيروس المَوْسَم بواسطة مقايسة اللويحات وقدر درجة الوسم باستخدام مقايسة التألق المناعي.

مرحباً، أنا سام جانغ من مختبرات DSO الوطنية، وأعمل في مختبر الدكتور وي ضمن برنامج الأمراض المعدية الناشئة بعد تخرجي من كلية الطب بجامعة سنغافورة الوطنية (NUS). سأوضح لكم اليوم كيفية وسم فيروس Denki فلورياً باستخدام صبغة Alexa flu التفاعلية مع الأجسام المضادة لغرض دراسات التصوير. تتميز صبغات Alexa flu باستقرار فائق وهي أقل حساسية لدرجة pH مقارنة بالأصباغ الشائعة مثل fluorescein و rhodamine، مما يجعلها مثالية للدراسات المتعلقة بالالتقاط الخلوي والنقل الإندوسومي للفيروس.

سيسهل وسم فيروس حمى الضنك بصبغة Alexa فهم مسببات مرض حمى الضنك. لذا دعونا نبدأ. قبل تفاعل الوسم، قم بتحضير محلول وسم طازج وكاشف إيقاف وفقاً للبروتوكول المكتوب، وقم بتنقية فيروس حمى الضنك باستخدام وسادة السكروز، ثم أضف حجماً مناسباً من فيروس حمى الضنك المنقى إلى محلول الوسم في أنبوب طرد مركزي دقيق للوصول إلى تركيز 300 million forming units per milliliter.

يمكن زيادة هذه الكميات بشكل تناسبي. بالنسبة لوسم مجموعات من الفيروسات، قم بإعادة تشكيل صبغة Alexa floor المجففة بالتجميد بتركيز 1 millimolar في محلول التوسيم المنظم مباشرة قبل تفاعل الوسم.

قلل من التعرض للضوء بدءاً من هذه الخطوة فصاعداً. ولغرض التوضيح، سيُترك صبغ Alexa floor دون حماية من الضوء. أضف 800 µL من صبغ Alexa flow بتركيز 1 mM إلى فيروس dengue المخفف مع التقليب برفق باستخدام رأس الماصة الدقيقة.

تُحضن العينات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء، مع التقليب عن طريق القلب اللطيف كل 15 دقيقة. بعد مرور ساعة واحدة، يتم تدوير الأنابيب بجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة. يتم سحب 800 µL من المنطقة الفرعية مع التقليب بلطف باستخدام الماصة الدقيقة، ثم تُحضن لمدة ساعة إضافية في درجة حرارة الغرفة، مع الحماية من الضوء والتقليب عن طريق القلب اللطيف كل 15 دقيقة.

في هذه الأثناء، يتم موازنة عمود التنقية باستخدام 25 milliliters من منظم HNE. بعد فترة تحضين لمدة ساعة واحدة، يُوضع الفيروس المسمى على العمود ويُبدأ في تجميع السائل المار. املأ العمود بمنظم HNE.

بمجرد دخول جميع الفيروسات الموصومة إلى المصفوفة، تخلص من أول 2.5 milliliters من السائل المتدفق، واجمع الـ two milliliters التالية من جزء الفيروس الموصوم. قم بتجميد الفيروس الموصوم المنقى عند Minus 80 degrees Celsius. حدد عيار الفيروس الموصوم عن طريق مقايسة اللويحات.

في التجربة النموذجية، يجب ألا يُلاحظ انخفاض في عيار الفيروس يتجاوز عشرة أضعاف. وبعد عملية الوسم، يجب إجراء مقايسة مناعية فلورية لتقييم درجة الوسم. وللقيام بذلك، يتم تعداد الخلايا الفيروسية باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ثم إضافة الحجم المناسب من الخلايا إلى وسط النمو لتحقيق كثافة تبلغ 50,000 خلية لكل milliliter.

ضع 1 mL من الخلايا الفيروسية في كل بئر من أطباق ذات أربعة آبار تحتوي على غطاء زجاجي معقم. قم بتحضين الخلايا طوال الليل عند 37 °C مع 5% CO2. أخرج الطبق من المحضنة واشفط السائل الطافي من كل بئر، ثم أضف إلى الخلايا ما يقرب من 1 MOI من الفيروس المسمى في حجم 100 µL لمدة 10 دقائق عند 37 °C.

قم بإزالة اللقاح واغسل الخلايا باستخدام 0.5 milliliters من محلول PBS المنظم لكل بئر. كرر هذه العملية مرتين إضافيتين. قم بتثبيت الخلايا بإضافة 200 microliters من 3%per for multi height لكل بئر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 Minutes.

اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 0.5 milliliters من محلول PBS المنظم لكل بئر. قم بإنزال الخلايا باستخدام محلول الإنزال في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 Minutes. أزل غطاء النوم من البئر باستخدام ملقط دقيق.

قم بتصريف السائل الزائد عن طريق الضغط على حافة الغطاء. مرر حافة الغطاء على ورقة امتصاص. ضع جانب الخلية من الغطاء.

ضع 25 µL من الجسم المضاد لبروتين e الخاص بفيروس حمى الضنك على قطعة من البارفين. حضن العينة لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة مع حمايتها من الضوء. بعد ذلك، انقل غطاء الشريحة إلى طبق ذو ستة آبار وأضف 2 mL من محلول الغسيل لكل بئر.

قم بشفط السائل الطافي. كرر خطوات الغسل هذه مرتين إضافيتين بعد الغسلة الأخيرة. قم بإزالة غطاء الشريحة من البئر باستخدام ملقط دقيق.

قم بتصريف السائل الزائد عن طريق غمس حافة الغطاء. اسحبه برفق مقابل منديل ورقي. ضع جانب الخلية من الغطاء.

ضع 25 µL من الجسم المضاد الثانوي Alexa Fluor 488 anti-mouse على شريحة زجاجية. يتم التحضين لمدة 45 دقيقة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء. بعد اكتمال التحضين، انقل الشريحة إلى طبق سداسي الفجوات (six-well plate) واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 2 mL من محلول الغسيل لكل غسلة. بعد الغسلة الأخيرة، أخرج الشريحة من الفجوة واشطفها مرة واحدة بالماء منزوع الأيونات.

قم بتصريف السائل الزائد عن طريق غمسه في ورقة امتصاص. قم بتثبيت غطاء الشريحة على المجهر باستخدام 8 µL من محلول تثبيت خفيف. اترك محلول التثبيت ليتماسك طوال الليل في الهواء عند درجة حرارة 4 °C.

تكون العينة الآن جاهزة للفحص باستخدام مجهر فلوري أو مجهر بؤري (confocal). ضع قطرة صغيرة من زيت الغمر على سطح غطاء الشريحة وثبت الشريحة على منصة المجهر.

قم بضبط المنصة حتى تلامس عدسة المجهر الشيئية زيت الغمر. وللحصول على صورة واضحة، قم بإطفاء الأضواء المحيطة باستخدام برنامج Zes Zen. انقر فوق علامة التبويب الخاصة بالعدسة العينية للملاحظة المباشرة للعينة من خلال عدسة المجهر العينية.

ابحث عن حقل يحتوي على خلايا واضبط التركيز. الآن انتقل إلى وضع الالتقاط. ولتقليل التداخل بين الفلوروفورات، حدد مسارات منفصلة لـ Alexa Fluor 488 و Cy5.

قم بضبط الأصباغ وعمليات الاستحواذ لتناسب الإثارة والكشف المتتاليين. اضبط كسب طاقة الليزر والإزاحة لضمان عدم تعرض الصورة لتعريض زائد أو ناقص. التقط الصورة وحلل المنطقة ذات الأهمية باستخدام وظيفة التوضع المشترك.

يمكن استخدام معامل التداخل لتقدير درجة وسم فيروس dengue بواسطة صبغة Alexa Flo. وقد أُجري مقايسة فلورية مناعية بسيطة على الخلايا الفيروسية، ويمكن تقدير درجة الوسم من خلال التوضع المشترك للفيروس الموُسم مع صبغة anti e protein، حيث تراوح معامل تداخل التلوين بـ anti antibody من 0.65 إلى 0.8، مما يشير إلى أن ما يقرب من 65 إلى 80% من المتغيرات قد وُسمت بصبغة Alexa floor. ولكي تنجح عملية الوسم، من المهم تحضير محلول الوسم المنظم وبدء عملية التبريد الطازجة وإعادة تكوين صبغة Alexa floor قبل البدء في الوسم.

يمكن تحسين تركيز الصبغة المستخدمة بشكل أكبر لتناسب احتياجاتك. كما يمكن تكييف هذه الطريقة لوسم فيروس الدنغ باستخدام تقنية الوسم الأفقي لوسم فيروسات أخرى. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربة الوسم الخاصة بكم.