الحقن الفيروسي التجسيمي لتحرير الجينات العصبية المستهدفة في دماغ الفأر

قم بتأمين ماوس مخدر في إطار تجسيم.

قم بتطهير فروة الرأس المحلوقة ، ثم قم بعمل شق خط الوسط لكشف الجمجمة.

جفف الجمجمة واستخدم بيروكسيد الهيدروجين لتعزيز رؤية بريجما.

حدد موقع bregma و lambda ، ثم حدد المواقع المستهدفة.

حفر بعناية من خلال الجمجمة في المواقع المستهدفة.

قم بتوصيل المحقنة المملوءة بالفيروسات بالأداة التجسيمية.

يقوم الفيروس بتشفير Cas9 والحمض النووي الريبي أحادي الدليل لتحرير الجينوم في الخلايا العصبية التلفيف المسننة ، جنبا إلى جنب مع مراسل الفلورسنت لتسمية الخلايا العصبية المصابة.

اخفض المحقنة للوصول إلى التلفيف المسنن ، ثم حقن الفيروس ببطء لضمان التوزيع المنتظم.

ارفع المحقنة تدريجيا وكرر الحقن بإحداثيات إضافية.

توقف مؤقتا لفترة وجيزة لمنع التدفق العكسي ، ثم اسحب الإبرة ببطء.

كرر الإجراء على نصف الكرة المعاكس.

أخيرا ، قم بخياطة الشق.

النموذج جاهز الآن لمزيد من الدراسات.

حلق رأس الفأر المخدر من أجل التحضير لموقع الحقن. مباشرة 4٪ أيزوفلوران في مخروط الأنف. بعد ذلك ، ضع الماوس في أداة التجسيم. أدخل قضيب العضة في فمه حتى تسقط أسنانه في الفتحة قبل تثبيت قضبان الأذن.

تأكد من أن جسم على وسادة التدفئة وأن الأنف يقع في مخروط الأنف. بعد ذلك ، قم بتأكيد التخدير عن طريق إعطاء قرصة في القدم. ثم ضع دموعا اصطناعية لتليين العينين. بعد ذلك ، قم بمسح الرأس المحلوق باليود والليدوكائين.

الآن ، قم بعمل شق صغير على طول خط الوسط لفروة الرأس. جفف الجمجمة بمسحة واستخدم بيروكسيد الهيدروجين للمساعدة في تصور البرجما. باستخدام نطاق تشريح ، حدد موقع بريجما على الجمجمة وضع لقمة الحفر فوقها. اضبط الإحداثيات التجسيمية الرقمية للمستويات x و y و z على 0.

من أجل التأكد من تسوية الرأس على المحور ذيلي المنقاري y ، ضع لقمة الحفر على لامدا وقم بتسوية الرأس بحيث يكون إحداثي z مساويا تقريبا ل 0 عند بريجما ولامدا. للتأكد من تسوية الرأس على طول المحور x ، ضع لقمة الحفر على نقطة المنتصف بين بريجما ولاجدا وقم بقياس إحداثيات z على بعد 1 ملم من نقطة المنتصف على كلا الجانبين للتأكد من تساويها.

بعد ذلك ، قم بخفض الأيزوفلوران إلى 2٪ قبل وضع المثقاب فوق الإحداثيات المطلوبة ، وحفر الجمجمة بعناية. بعد حفر جميع الثقوب ، قم بلصق المحقنة المملوءة بالفيروسات على الأداة التجسيمية. قم بتوسيط المحقنة فوق الفتحة واضبط إحداثيات z عند الجمجمة على 0. اخفض المحقنة ببطء إلى أعمق عمق z وابدأ الحقن بمعدل 0.25 ميكرولتر في الدقيقة باستخدام حاقن تجسيم.

بعد اكتمال الحقن في أعمق عمق z ، انتظر دقيقة واحدة قبل رفعه إلى الإحداثيات التالية وابدأ الحقن مرة أخرى. استمر في هذا النمط حتى يتم حقن جميع إحداثيات الحقن z. بعد الحقنة الأخيرة ، انتظر دقيقتين قبل إزالة المحقنة. ثم قم بإزالة الماوس من أداة التجسيم وخياطة فروة الرأس. ضع الليدوكائين والكريم المضاد للبكتيريا على موقع الجراحة وقم بإعطاء مسكنات الألم قبل نقل إلى غرفة الانتعاش الساخنة.