واحدة رسم الخرائط ذات الصلة مصير الخليوي في الزرد

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء رسم خرائط للمصير وتتبع النسب للخلايا المفردة المختارة في أجنة الزرد. يتم تحقيق ذلك عن طريق الاقتران الكيميائي بين الفلورسين المحبوس في قفص وديكستران عالي الوزن الجزيئي. بعد ذلك ، يتم حقن ديكستران الفلورسين المحضر في أقفاص صغيرة في أجنة الزرد ، والتي يتم تنشيطها بعد ذلك في خلايا مختارة باستخدام امتصاص الفوتونين.

بعد التنشيط الضوئي للأجنة ، يتم إجراء التحليل الكيميائي المناعي للكشف عن الفلورسين ديكستران غير المأزق من أجل تحديد مصير الخلايا المنشطة. في النهاية ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد مساهمة النسب وتوطين الأنسجة للخلايا المفردة المنشطة بالصورة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل الفحص المجهري الفلوري القياسي ، هي أنه يمكن استخدامها لتسمية الخلايا المفردة بشكل تفاضلي لرسم خرائط الإيمان.

يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء التنموي مثل كيف يمكن للخلايا السليفة غير المتمايزة أن تساهم في أنواع الأنسجة المختلفة ، ويعد العرض المرئي أمرا بالغ الأهمية نظرا لأنه يصعب تعلم خطوات تركيب الجنين وتنشيط الصورة بناء على وصف النص وحده. قبل البدء ، قم بتصنيع ديكستران الفلورسين المحبوس وتخزينه في أنابيب مغطاة برقائق معدنية. ثم حقن الأجنة الدقيقة في مرحلة خلية واحدة إلى خليتين باستخدام القفص المركب فلورسين ديكستران.

بعد أن تصل الأجنة إلى المرحلة المناسبة من التطور ، قم بتغطيتها. ثم قم بتركيب الأجنة المطلية في وحدات منخفضة الذوبان لتنشيط الصورة. عندما يكون النشأة قد تصلب تحميل LSM خمسة 10 البرمجيات.

ضع مرشحا أصفر شفافا في مسار شعاع الضوء الأبيض ثم حدد مسح صورة جديدة ضوئيا وانقر فوق بدء وضع الخبير. حدد علامة تبويب الليزر ، وقم بتشغيل مكواة الأرجون ومصادر ليزر مي تاي. اضبط الطول الموجي مي تاي على سبعة 40 نانومتر.

بعد ذلك ، حدد علامة تبويب التكوين. قم بتعيين تكوينات المسار البصري لأيون الأرجون وليزر مي تاي. ثم حدد علامة التبويب المسح الضوئي.

قم بتغيير الهدف إلى 20 في 0.8. اضبط سرعة المسح القصوى بالنقر فوق الحد الأقصى لوضع الضبط وطريقة الرقم إلى متوسط الخط وواحد على التوالي ضمن علامة تبويب القنوات ، قم بإلغاء تحديد جميع مصادر الليزر باستثناء mi tai. بعد ذلك ، ضع عداد الطاقة في مسار الحزمة الضوئية ، ثم حدد الزر con لتنشيط المسح المستمر.

اضبط نسبة الإرسال حتى يقرأ عداد الطاقة متوسط طاقة ليزر تبلغ 47 مللي واط. ثم أوقف الفحص عن طريق تحديد زر الإيقاف أسفل علامة تبويب القنوات. قم بإلغاء تحديد مصدر ليزر مي تاي وحدد مكواة الأرجون.

ثم حدد زر XY السريع مرة أخرى ضمن علامة تبويب القنوات ، واضبط الثقب. اكتشف الكسب وتضخيم الإزاحة وتضخيمه مرة أخرى ليزر الحديد Argonne لتحقيق أفضل جودة للصورة. باستخدام وحدة التحكم في المرحلة ، ابحث عن الخلية وركز عليها لتنشيطها ، ثم انقر فوق زر الإيقاف باستخدام أداة الاقتصاص ، قم بقص الخلية المنشطة بحيث يعرض عامل الاقتصاص ضمن علامة تبويب الوضع من 50 إلى 70.

ثم أوقف الفحص عن طريق تحديد زر الإيقاف الموجود أسفل علامة تبويب القنوات. قم بإلغاء تحديد ليزر أيون الأرجون وحدد ليزر My Tai ضمن علامة تبويب الوضع. اضبط سرعة المسح على 31.46 ثانية.

ثم حدد الزر الفردي لبدء المسح الضوئي لتنشيط الفوتونين لديكستران الفلورسين المحبوس في الخلية المحددة. بعد التنشيط ، انتقل إلى علامة التبويب القنوات والآن قم بإلغاء تحديد ليزر مي تاي وأعد تحديد ليزر أيون الأرجون. ثم ضمن الوضع ، اضبط عامل التكبير / التصغير على واحد. مقبل.

ضمن عنوان السرعة ، انقر فوق الزر الحد الأقصى لتعيين أسرع سرعة مسح. لمراجعة المنطقة التي تم تنشيط الصورة ، حدد سريع xy. ثم حدد علامة تبويب القنوات واضبط الثقب واكتشفه مرة أخرى ، وتحقق من أن المنطقة التي تم تنشيط الصورة لم يتم استئصالها بالليزر.

بعد إعداد الأجنة المنشطة بالصورة للكشف المناعي عن الفلوريسين ديكستران باتباع البروتوكول الموضح في المخطوطة المصاحبة. اغسل الأجنة ست مرات في PBT ومرتين في المخزن المؤقت AP. ثم انقل الأجنة إلى تسعة ألواح بئر في المخزن المؤقت AP.

بعد ذلك ، قم بسحب المخزن المؤقت لنقطة الوصول وأضف N-B-T-B-C-I-P. أوقف تطور بقع N-B-T-B-C-I-P عن طريق شفط محلول N-B-T-B-C-I-P. ثم اغسل الأجنة في PBT.

الآن استعادة الأجنة ورجها على منصة دوارة لمدة خمس دقائق من درجة حرارة الغرفة. ثم كرر PBT الغسيل مرتين أخريين. أخيرا ، قم بتركيب الأجنة في 0.6٪ من الصخور الذائبة المنخفضة واحصل على صور للخلايا المنشطة بالصور باستخدام مجهر مركب منتصب.

في هذا الشكل ، تظهر صورة المجال الساطع على اليسار وصورة فلورية تظهر على يمين جنين سمكة الزرد المحبوس في قفص قبل تنشيط الصورة. كما هو موضح هنا ، تم تنشيط الجنين بالصورة في أحد الجسيدات المشار إليها بالسهم الموجود في شكل المجال الساطع على اليسار بطول موجي يبلغ سبعة 40 نانومتر ، ووقت مسح يبلغ 31 ثانية ، ومتوسط قوة ليزر يبلغ 47 مللي واط. في الشكل الموجود على اليمين بعد تنشيط الصورة ، يمكن ملاحظة التألق من ديكستران الفلورسين غير المذكور في هذا الشكل.

تصوير التلوين المناعي للفلورسين ديكستران غير المجسم منطقة صغيرة في الصفيحة الجانبية ، الأديم المتوسط من 10. لذلك تم تنشيط جنين مرحلة العث بالصورة باستخدام نفس معلمات الليزر كما في الشكل السابق باستخدام إجراء الكشف المناعي. يمكن تحديد المنطقة المنشطة كما هو موضح هنا بواسطة السهم بأقل قدر من تلطيخ الخلفية باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء تحليل إضافي مثل التلوين المناعي لعلامات مختلفة محددة للأنسجة من أجل توصيف موقع ومصير الخلايا المصنفة بشكل أفضل. باستخدام هذه التقنية ، فإنه يمهد الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الأوعية الدموية لدراسة أصل الشرايين في الخلايا السلفية الوريدية في تطوير أجنة الزرد. لا تنس أنه عند العمل مع الكواشف الكيميائية مثل NBT و BCIP ، يمكن أن تكون شديدة الخطورة ويجب ارتداء القفازات دائما.