تصوير عابرات الكالسيوم السريعة في النهايات العصبية للفأر باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر

ابدأ بغرفة تجريبية مطلية بالسيليكون المطاط الصناعي تحتوي على عضلة فأر مؤمنة موضوعة تحت مجهر متحد البؤر.

تغمر العضلة في محلول فسيولوجي يحتوي على مثبطات تمنع تقلصات العضلات.

يتم وضع جذع العصب المسمى بصبغة الكالسيوم الفلورية داخل قطب الشفط المتصل بمحفز كهربائي.

عند التقاطع العصبي العضلي ، يتم توصيل العصب المحيطي بالعضلة.

ضع حافزا كهربائيا على العصب باستخدام القطب. يؤدي هذا إلى تدفق سريع لأيونات الكالسيوم التي ترتبط بصبغة الكالسيوم داخل الخلايا.

تضيء الوصلة العصبية العضلية لإثارة صبغة الكالسيوم ، مما يؤدي إلى تألقها.

بعد ذلك ، التقط صورا عالية الدقة لتسجيل عابرات الكالسيوم السريعة في النهايات العصبية الطرفية.

حدد منطقة الاهتمام وقم بقياس شدة التألق.

تشير الزيادة السريعة في شدة التألق إلى تدفق الكالسيوم في النهايات العصبية الطرفية ، بينما يعكس الانخفاض إزالة الكالسيوم.

املأ نظام التروية بمحلول Ringer الذي يحتوي على 10 ميكرومولار D-tubocurarine وقم بتشغيل مضخة شفط التروية لبدء التروية. في المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر ، أو برنامج LSCM ، اختر الفيزيولوجيا الكهربية ووضع الاستحواذ لتعيين معلمات التصوير. في إعدادات قائمة الوظيفة، حدد إعدادات المشغل لتشغيل المحفز بنبض مزامنة المجهر وقم بتعيين حقل المشغل على الإطار إلى قناة OUT 1.

قم بتحويل وضع المسح إلى xyt بتردد مسح 1,400 هرتز. يجب أن يكون عامل التكبير 6.1 مع فتح الثقب بالكامل. تأكد من تشغيل وضع x ثنائي الاتجاه المتقاطع المتسلسل. ثم اضبط الحد الأدنى للوقت لتشكيل إطار عند 52 مللي ثانية وجمع الإطارات في فيديو أولي عند 20 إطارا. اضبط الطول الموجي للإثارة لليزر الأرجون على 488 نانومتر ، مع 8٪ من طاقة الإخراج.

عند ضبط المعلمات ، اضغط على زر الوضع المباشر للحصول على معاينة مباشرة للأطراف العصبية المحملة بالصبغة. في الوضع المباشر ، ابحث عن منطقة الاهتمام ، أو عائد الاستثمار ، للحصول على أفضل تركيز ، ثم قم بتحويل التأخير على المحفز بمقدار 2 مللي ثانية أقل بالنسبة للقيمة السابقة. وقم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات للحصول على 26 تسلسلا عن طريق تحويل كل تسلسل مللي ثانية من التسلسل السابق.