خفض التحميل : أداة مفيدة لفحص مدى تقاطع الفجوة بين الخلايا العصبية توصيلات الراسم الشبكية

الهدف العام من تجربة تحميل القطع التالية هو فحص مدى اقتران تتبع تقاطع الفجوة بين الخلايا العصبية في شبكية العين السليمة في ظل ظروف الإضاءة الخاضعة للرقابة. يتم تحقيق الخطوة الأولى عن طريق قطع شبكية العين بشفرة حادة مغموسة في محلول من البيوتين العصبي ، وهو جزيء تتبع يمكن أن ينتشر من خلال قنوات تقاطع الفجوة المفتوحة ، ولكن ليس أغشية الخلايا. في الخطوة الثانية ، يتم احتضان شبكية العين في محلول الرنين ، مما يسمح بانتشار التتبع من خلال قنوات تقاطع الفجوة المفتوحة.

إذا كان اقتران تقاطع الفجوة ضعيفا ، فسيقتصر مضان البيوتين العصبي على الخلايا العصبية الشبكية القريبة من القطع. في المقابل ، إذا كان اقتران تقاطع الفجوة قويا ، اكتشاف التألق في الخلايا العصبية في الشبكية البعيدة عن القطع. الميزة الرئيسية لتحميل القطع على التقنيات الحالية هي أنه من الأسهل القيام به على الخلايا العصبية ذات أجسام الخلايا الصغيرة في أنسجة الشبكية العصبية السليمة.

أنه من الأسهل التحكم في ظروف الإضاءة أثناء التحميل المقطوع مقارنة بالدراسة الفيزيولوجية الكهربية للخلايا العصبية المفردة في أنسجة الشبكية السليمة. لأن المحفزات الضوئية المستخدمة أثناء التسجيل الكهربائي يمكن أن تؤدي في حد ذاتها إلى تغييرات في اقتران تقاطع الفجوة ، مما يدل على أن هذه التقنية سيكون الدكتور تشو تشوي ، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري. في هذا الإجراء ، يتم الاحتفاظ بالسمكة الذهبية في ظلام دائم في النهار لمدة ساعة على الأقل قبل الجراحة ، ويتم أيضا تنفيذ جميع الخطوات التالية حتى يتم إصلاح أنسجة الشبكية خلال النهار في ظلام دائم ، وتخدير السمكة الذهبية بعمق عن طريق إضافة 150 ملليغرام لكل لتر من سلفونات الميثان إلى مياه الحوض.

ثم قم بالتضحية بالسمكة الذهبية وفقا للإرشادات الفيدرالية والجامعية وقم بإزالة مقل عيونها بعناية. بعد ذلك ، قم بإزالة الجزء الأمامي من كل مقلة عين. ثم ضع قطعة من ورق الترشيح أعلى الجزء الخلفي من العين واقلب ورق الترشيح والعين بحيث يكون ورق الترشيح أسفل الجزء الخلفي من العين.

الآن ، قم بإزالة الجزء الخلفي من العين برفق ، بما في ذلك الصلبة والظهارة الصبغية من السمكة الذهبية الداكنة المتكيفة. قطعت شبكية العين العصب البصري بمقص ناعم. يجب الآن ربط السمكة الذهبية العصبية ، جانب المستقبلات الضوئية الموجهة لشبكية العين لأعلى بورق الترشيح قبل الاستئصال ، بينما تخضع الأسماك للتخدير بمقدار خمسة ملليلتر مؤكسج بمحلول رنين قائم على الكربونات مع أو بدون دواء اختبار لكل بئر من ستة صفيحة بئر بعد تشريح شبكية العين العصبية السليمة من الجزء الخلفي من العين.

انقل شبكية العين إلى الآبار أثناء الظلام المستمر. ثم أغلق الآبار بالشكلي واترك الأنسجة تحتضن لمدة 30 دقيقة. قم بإعداد 100 ميكرولتر من محلول التتبع عن طريق إذابة 0.5٪ من البيوتين العصبي في محلول الرنين مباشرة قبل قطع شبكية العين.

بعد ذلك ، أضف محلول البيوتين العصبي إلى طبق بتري زجاجي. ثم اضغط برفق على ورق الترشيح الذي تعلق عليه شبكية العين على منشفة ورقية. لإزالة الرنين الزائد، اغمس شفرة الحلاقة في محلول البيوتين العصبي وقم بعمل قطع شعاعي عمودي عبر شبكية العين وورق الترشيح.

بعد ذلك ، اغمس شفرة الحلاقة في محلول البيوتين العصبي مرة أخرى وقطع شبكية العين مرة ثانية. كرر هذا حتى أربع جروح لكل شبكية العين. في هذه الخطوة ، انقل شبكية العين إلى جرعات جديدة ، متوسطة مع أو بدون دواء اختبار لمدة 15 دقيقة للسماح بالتحميل والانتشار.

اغسلها ثلاث مرات باستخدام جرنات جديدة ، متوسطة مع أو بدون دواء اختبار لمدة خمس دقائق لكل منهما. ثم قم بإصلاح شبكية العين باستخدام 4٪ بارا فورمالديهايد في محلول عازلة فوسفات 0.1 مولار في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، اغسل شبكية العين ب 0.1 مولار PBS طوال الليل عند أربع درجات مئوية عن طريق وضعها في الثلاجة في اليوم التالي.

تفاعل شبكية العين مع 2٪ ستربتافيدين Alexa 4 88 في 0.1 مولار PBS و 0.3٪ تريتون × 100 إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام لكل مليلتر وتحضنه طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي. اغسل شبكية العين ثلاث مرات باستخدام 0.1 مولار PBS في درجة حرارة الغرفة في كل مرة لمدة 10 دقائق.

افصل شبكية العين عن ورق الترشيح في PBS. ثم باستخدام فرشاة دقيقة ، قم بتركيب جانب المستقبلات الضوئية لشبكية العين لأعلى على شريحة مع وسيط تركيب درع متجه. انقل الشريحة إلى مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر والتقط صورا بنفس دقة التكبير والإعدادات لكل حالة تجريبية بحيث يمكن عرض مقارنات لتأثيرات الظروف التجريبية المختلفة على مدى اقتران التتبع الوظيفي للفجوة.

فيما يلي مدى اقتران متتبع الخلايا المستقبلة للضوء أثناء النهار في الظلام المستمر مقارنة بالنهار في الظلام المستمر في وجود مضاد انتقائي للدوبامين D ثنائي المستقبل. لاحظ أن ماكينة الحلاقة المقطوعة في كلتا الصورتين موجودة على اليسار. على الرغم من أن صورة واحدة قد تحتوي على جميع الخلايا المسماة ، فمن المستحسن أن يقوم المرء بجمع مكدس Z لمنطقة الاهتمام وطيها في صورة واحدة معروضة.

فيما يلي مدى اقتران تتبع الخلايا المستقبلة للضوء حيث يتحرك المرء بالتتابع من خلال Zack هذا. لاحظ أن ماكينة الحلاقة المقطوعة في هذه الصورة موجودة على اليمين. لتحديد مدى اقتران التتبع في متصفح الصور LSM ، افتح الصورة ، ثم انقر فوق تصدير واحفظ الصورة كشريط مقياس ملف غير مضغوط TIF 16 بت يجب تضمينه في صورة TIFF هذه باستخدام برنامج NIH image J.

قم بقياس شدة التألق ل Alexa 4 88 المسمى البيوتين العصبي من صور التكبير المنخفض لشبكية العين المثبتة على الثقب. افتح ملف TIFF باستخدام برنامج Image J ثم ارسم خطا مستقيما يتوافق مع شريط المقياس. بعد ذلك ، انتقل إلى التحليل وتعيين المقياس وأدخل المسافة المعروفة ووحدة الطول.

ثم انقر فوق موافق. الآن يمكن تقديم قياسات التألق في وحدات معايرة مثل المليمترات. بعد ذلك ، حدد مجال الاهتمام باستخدام أداة التحديد المستطيل.

يجب وضع ذروة الفلورسنت على الحد الأيسر لاختيارك. تأكد من عدم وجود إشارة فلورية بالقرب من الحدود اليمنى. انقر فوق تحليل ورسم ملف تعريف لبيانات التحكم أثناء النهار التي تم الحصول عليها في الظلام المستمر.

يتم عرض منحنى ذو اضمحلال أسي من اليسار إلى اليمين. ثم انقر فوق نسخ في النافذة المنبثقة والصقه في Excel. يوجد الآن عمودان ، أحدهما يوضح المسافة من القطع والآخر يظهر شدة التألق كدالة للمسافة من القطع.

على سبيل المقارنة ، تتكرر الخطوات المذكورة أعلاه مع البيانات التي تم الحصول عليها في ظلام دائم في النهار. في وجود بصق إخوان ، اقسم كل قيمة مضان خام على الحد الأقصى لقيمة التألق للحصول على شدة التألق النسبية. انسخ عمودين يقابلان المسافة من القطع وشدة التألق النسبية ، ثم الصقهما في برنامج الأصل.

يتم عرض هذه الخطوات لكل من التحكم أثناء النهار والبصق أثناء النهار. تشغيل البيانات في هذه المرحلة تناسب النتائج مع الاضمحلال الأسي. الوظيفة الأولى ، قارن قيم ثابت الفضاء في ظروف تجريبية مختلفة باستخدام اختبار T أو Inova.

يتم عرض الدوال الأسية والتحليلات الإحصائية للتحكم أثناء النهار ، وبيانات النقطة النهارية ، وبيانات التحكم الليلي للمقارنة. تفعيلك. فيما يلي أمثلة على مدى اقتران متتبع الخلايا المستقبلة للضوء في شبكية السمكة الذهبية المتكيفة المظلمة في النهار A ، والليل B ، وفي النهار في وجود مضاد انتقائي للدوبامين D اثنين من مستقبلات كما هو موضح من تقنية تحميل القطع. تم التقاط جميع الصور متحد البؤر باستخدام نفس الإعدادات للمقارنة.

في هذا الرسم البياني ، يتم رسم شدة التألق لثلاثة ظروف تجريبية كدالة للمسافة من القطع وتركيبها بواسطة الدالة الأسية. تستخدم تقنية تحميل القطع لتحديد مدى اقتران تتبع الفجوة عن طريق حساب القيم الثابتة للفضاء كما هو موضح هنا لثلاثة شروط تجريبية. يمكن أيضا استخدام تقنية التحميل المقطوع للتحقيق في المشابك الكهربائية بين أنواع الخلايا الأخرى في شبكية العين وفي الأنواع الأخرى.

على سبيل المثال ، يوضح هذان الشكلان أن الخلايا الأفقية من النوع A والنوع B من الأرنب تظهر اقتران تتبع متماثل يتبع ، وقطع التحميل ، ونشر البيوتين العصبي في ظل ظروف مظلمة متكيفة. لقد استخدمنا تقنية تحميل القطع لدراسة مدى انتشار التتبع من خلال تقاطعات الفجوة بين القضبان والأقماع في النهار والليل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد ما إذا كان اقتران التتبع بين الخلايا العصبية الأخرى في الشبكية يتم التحكم فيه بواسطة ساعة الشبكية و أو عن طريق ظروف مظلمة فاتحة محددة.

يمكن استخدامه أيضا لدراسة اقتران التتبع بين الخلايا العصبية في مناطق الدماغ الأخرى.