Hyperinsulinemic - سوي سكر الدم في الفئران المشابك ، وإدراكا بلا حدود

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم عمل الأنسولين في الجسم بأكمله وفي أنسجة محددة في الفئران الواعية غير المجهدة دون الحاجة إلى التعامل معها يدويًا. ويتم تحقيق ذلك عن طريق زرع قسطرة جراحيًا في الوريد الوداجي لعمليات التسريب، وقسطرة أخرى في الشريان السباتي للحصول على عينات الدم. وبعد فترة نقاهة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام، يتم تسريب الأنسولين للفئران التي صامت لمدة خمس ساعات لتحقيق حالة فرط أنسولين الدم الفسيولوجي.

يتم بعد ذلك قياس مستويات الجلوكوز من القسطرة الشريانية، ويتم الحفاظ على حالة U glycemia عن طريق ضبط معدل تسريب الجلوكوز. تتيح هذه التجربة قياس الاختلافات في حساسية الأنسولين في الجسم بالكامل بناءً على العلاقة المباشرة بين معدل تسريب الجلوكوز اللازم للحفاظ على حالة U glycemia وعمل الأنسولين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية لسحب عينات الدم مثل قطع الذيل، هي أن القسطرة الشريانية المزروعة جراحيًا توفر لنا وصولاً وعائيًا للفأر، مما يتيح لنا الحصول على عينات دم دون الحاجة إلى التعامل المباشر مع الفأر.

وهذا يسمح لنا بإجراء هذه التجارب على فئران غير مجهدة وغير مقيدة. يتم تحضير القثطرة الشريانية عن طريق إدخال قطعة مشطوفة من أنبوب PE 10 في قطعة طولها ستة سنتيمترات من أنبوب astic، بحيث يبرز أنبوب PE 10 بمقدار 0.9 سنتيمتر من الـ sel. أما القثطرة الوريدية فهي عبارة عن قطعة ذات طوق من أنبوب SEL بطول ستة سنتيمترات.

يتم تركيب الكتلة عن طريق إدخال قطع بطول 3 cm من PE 20 في كل من موصلين من الفولاذ المقاوم للصدأ عيار 25 وبقطر 1.3 cm، وبزاوية تقريبية تبلغ 120 درجة. يتم إدخال هذه الموصلات في كمية من لاصق السيليكون الطبي كما هو موضح هنا. لبدء عملية زرع القسطرة، ضع فأراً مخدراً على سطح عمل نظيف باستخدام تقنية تعقيم. قم بعمل شق جراحي على بُعد 5 mm إلى يمين الخط الناصف.

قم بعزل الوريد الوداجي الأيمن. اربط الوريد الرأسي بعناية باستخدام خيط جراحي حريري، واربط قطعة أخرى من الخيط بشكل فضفاض عند الطرف الذيلي. بعد ذلك، قم بالقص أسفل رباط الوريد الرأسي مباشرةً باستخدام مقص زنبركي، ثم أدخل القسطرة حتى الوصول إلى خرزة التثبيت.

اربط خيط جراحي خلف الخرزة، ثم تأكد من أن القسطرة تقوم بسحب العينات عن طريق توصيل الطرف الحر للقسطرة بمحقنة سحب عينات. ولوضع القسطرة الشريانية، قم بعمل شق صغير على بعد خمسة مليمترات إلى يسار عظمة القص وفي اتجاه رأسي بالنسبة للشق الأول. قم بعزل الشريان السباتي الأيسر، ثم اربط الجزء الرأسي.

أنهِ العملية باستخدام خيط جراحي حريري واربطه عقدة رخوة. ضع قطعة أخرى من الخيط الجراحي على الطرف القريب من الوعاء المكشوف. بعد ذلك، قم بوضع مشبك على الطرف البعيد للوعاء.

ثم اقطع أسفل الطرف المربوط مباشرةً باستخدام مقص زنبركي. أدخل القسطرة بعناية حتى تصل إلى الملقط. حرر الملقط بعناية وقم بدفع القسطرة وصولاً إلى وصلة Astic P.

اربط الرباطات بإحكام في القسطرة، وتحقق من قدرة القسطرة على أخذ العينات عن طريق توصيل الطرف الحر للقسطرة بمحقنة أخذ العينات. بعد ذلك، اقلب الحيوان وقم بعمل شق صغير بين لوحي الكتف، ثم مرر إبرة عيار 14 تحت الجلد من الشقوق الأمامية وصولاً إلى هذا الشق في الظهر. قم بتمرير القسطرات عبر الإبرة لإخراجها من ظهر الفأر.

قم بتوصيل القسطرة الشريانية والوريدية بالموصلات المناسبة في هوائي الفأر للوصول إلى العينات أو الـ masa. بعد ذلك، أدخل الـ masa في الشق الموجود بين لوحي الكتف. أغلق كلا الشقين باستخدام خيوط نايلون جراحية.

تحقق من نفاذية كلا القسطرتين. ضع الفأر في قفص نظيف ودافئ للتعافي، واترك الفأر يتعافى لمدة خمسة أيام على الأقل قبل إجراء مشبك الإنسولين. إن الخطوة الأكثر صعوبة في تنفيذ مشبك فرط إنسولين الدم مع الحفاظ على مستوى سكر الدم في الفئران هي محاولة الحفاظ على مستوى سكر الدم.

تتمتع الفئران بعملية أيض سريعة جداً، ويمكن أن تتغير مستويات الجلوكوز لديها بشكل ملحوظ خلال فترة التجربة. يتطلب الأمر بعض التدريب لتطوير القدرة على تقدير كيفية تغير مستويات الجلوكوز لدى الفأر طوال التجربة، ومن ثم كيفية ضبط معدل تسريب الجلوكوز للحفاظ على حالة U glycemia. يظهر هنا إعداد عملية القمط (clamp) القياسية.

يتم توصيل ثلاثة من أجهزة infusion eight، وهي الجلوكوز والأنسولين وكريات الدم الحمراء المغسولة، بوصلة رباعية الاتجاهات متصلة بمفصل دوراني (swivel) ومعلقة فوق الفأر. يتم توصيل منفذ التسريب في المفصل الدوراني بالقسطرة الوريدية. قبل توصيل الفأر، يملأ جميع خطوط أجهزة infusion eight بالمحلول الملحي.

بعد ذلك، املأ خط أخذ العينات بمحلول ملحي يحتوي على الهيبارين. اترك سرنجة تحتوي على محلول ملحي هيباريني متصلة بالجزء العلوي من الوصلة الدوارة، ثم استخدم سرنجة للتطهير. ابدأ بصيام الفئران لمدة تتراوح بين خمس إلى ست ساعات قبل بدء عملية التثبيت (clamp).

ادرس الحالة بعد ثلاث ساعات من الصيام، ثم زن الفأر وقم بتوصيل القسطرة الوريدية والشريانية بخطوط التسريب وأخذ العينات على التوالي. قبل 15 دقيقة من بدء عملية التثبيت (clamp)، أدخل قطرة جلوكوز فارغة في مقياس الجلوكوز المحمول. بعد ذلك، اسحب حوالي 50 µL من الدم في سرنجة التطهير لإزالة أي محلول ملحي من الخط، ثم افصل سرنجة التطهير.

قم بقياس مستوى جلوكوز الدم عن طريق ملامسة شريط قياس الجلوكوز لقطرة الدم المتكونة عند نهاية الأنبوب. بعد ذلك، أدخل حقنة ذات إبرة غير مدببة في خط أخذ العينات واسحب 50 µL من الدم. قم بتفريغ الدم في أنبوب مغلف بـ EDTA، ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً لجمع البلازما من أجل قياس الهرمونات والمستقلبات الأساسية.

عند هذه النقطة، أعد إدخال محقنة التصفية واسحب المكبس. لإزالة فقاعات الهواء، أعد حقن 50 µL من الدم التي تم سحبها في الأصل. دوّن قيمة جلوكوز الدم الظاهرة على جهاز قياس السكر.

بعد مرور 10 دقائق، استخدم مقياس الغلوكوز ومحقنة التنظيف لتكرار قياس غلوكوز الدم، ثم اسحب 50 µL أخرى من الدم للحصول على عينة بلازما أخرى. بعد أخذ قياسات خط الأساس الثانية، قم بتعبئة خطوط التسريب الخاصة بالغلوكوز، والأنسولين، وكريات الدم الحمراء المغسولة بمحلول ملحي وصولاً إلى الموصل رباعي الاتجاهات. قم بتوصيل الموصل رباعي الاتجاهات بالأنابيب المتصلة بمنفذ التسريب الدوار.

ابدأ بتسريب كرات الدم الحمراء المغسولة بمحلول ملحي. اضبط معدل التسريب لاستبدال الحجم الإجمالي للدم الذي يتم أخذ عينات منه على مدار فترة الدراسة. بمجرد وصول تسريب كرات الدم الحمراء إلى الفأر، ابدأ تسريبات الإنسولين والجلوكوز.

هذا هو الوقت صفر دقيقة. يتم تسريب الإنسولين بمعدل ثابت ومحدد مسبقاً. ويتم تقدير معدل تسريب الجلوكوز الأولي بناءً على مستويات جلوكوز الدم الأساسية والخبرة السابقة.

خلال الساعتين التاليتين، قم بقياس مستويات جلوكوز الدم باستخدام مقياس الجلوكوز، واضبط معدل تسريب الجلوكوز للحفاظ على مستوى سكر الدم المستهدف. قم بتسجيل قراءات الجلوكوز الجديدة ومعدلات تسريب الجلوكوز على فترات زمنية مدتها 10 دقائق؛ وعند الدقيقة 100 والدقيقة 120، اجمع عينات دم إضافية لقياس مستوى إنسولين البلازما وأي هرمونات أو نواتج أيض أخرى. يوضح الشكل هنا المخطط الزمني لمستويات الجلوكوز طوال إجراء عملية التثبيت (clamp)، مما يبين مدى الحفاظ على استقرار سكر الدم في كل من الفئران التي تغذت على نظام غذائي عادي والفئران التي تغذت على نظام غذائي عالي الدهون طوال فترة التثبيت. ويظهر المخطط الزمني لمعدل تسريب الجلوكوز أن المعدل اللازم للحفاظ على سكر الدم كان أقل بكثير في المجموعة التي تغذت على نظام غذائي عالي الدهون، مما يشير إلى وجود خلل في عمل الإنسولين في الجسم بأكمله.

كما كانت مستويات الإنسولين في حالة الصيام وأثناء تثبيت مستوى الإنسولين (clamp) أعلى في المجموعة التي تغذت على نظام غذائي عالي الدهون، مما يدعم بشكل أكبر وجود نمط ظاهري مقاوم للإنسولين. وفي هذه الفئران، يُستخدم الغلوكوز المسمى بالتريتيوم لتقدير معدل ظهور الغلوكوز الداخلي. ويعد Endo a مؤشراً على إنتاج الغلوكوز الكبدي، بينما يثبط الإنسولين endo A تماماً في فئران المجموعة الضابطة.

يضعف هذا الكبح لدى الفئران التي تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون. وبالمثل، يُستخدم جلوكوز TRID لتقدير معدل اختفاء الجلوكوز من الجسم بالكامل. وتتأثر قدرة الأنسولين على تحفيز RD لدى الفئران التي تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون.

يُستخدم 2-ديوكسي جلوكوز الذي يحتوي على الكربون 14 لتقييم مؤشر استقلاب الجلوكوز RG، وهو مقياس لامتصاص الجلوكوز النوعي في الأنسجة. وكما يظهر في هذا المثال، فإن امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين في العضلات الهيكلية يكون ضعيفاً في الفئران التي تغذت على نظام غذائي عالي الدهون. وبشكل عام، سيواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبة في الجراحة المجهرية اللازمة لزراعة القساطر الشريانية والوريدية.

تتطلب هذه الجراحة مهارات متخصصة للغاية وتحتاج إلى ممارسة مستمرة على مدى عدة أشهر لإتقان إجراء الجراحة الخاصة بمشبك سكر الدم عالي الأنسولين (hyperinsulinemic glycemic clamp)؛ وتكمن الصعوبة مجدداً في محاولة الحفاظ على مستوى سكر الدم في نموذج حيواني يتميز بعملية أيض مرتفعة جداً.