تصوير ديناميكيات الكالسيوم في خلايا الشعر الجانبية لسمك الزرد اليرقي

خذ يرقة الزرد المعدلة وراثيا مشلولة مثبتة في غرفة التروية.

تعبر اليرقة عن مؤشرات الكالسيوم الموضعية الغشاء في خلايا الشعر في الصاري العصبي ، وهو أحد مكونات نظام الخط الجانبي الذي يكتشف حركة الماء.

تتكون خلايا الشعر من حزم شعر قمية ومناطق قاعدية قبل المشبكية ، والتي تشكل نقاط اشتباك عصبي مع الخلايا العصبية الواردة لنقل الإشارات.

تحت المجهر متحد البؤر ، استخدم تكبيرا منخفضا لوضع ماصة نفاثة سائلة بالقرب من اليرقة.

قم بزيادة التكبير لتحديد موقع الصاري العصبي، وإعادة وضع الماصة بالقرب منه، والتبديل إلى

التصوير الفلوري.

توصيل نبضات سائلة لتشتيت حزم الشعر ، وفتح قنوات النقل الميكانيكي لتدفق الكاتيون القمي ، بما في ذلك أيونات الكالسيوم.

ترتبط مؤشرات الفلورسنت الضعيفة بالكالسيوم ، مما يتسبب في زيادة موضعية في التألق.

يؤدي تدفق الكاتيون إلى إزالة استقطاب الخلية ، مما يؤدي إلى دخول الكالسيوم عبر القنوات ذات الجهد الكهربائي في المشبكي القاعدي ، حيث يرتبط بالمؤشرات ويزيد من التألق محليا.

تصور ديناميكيات الكالسيوم القمي والقاعدي في الوقت الفعلي.

في هذا الإجراء ، قم بإعادة ملء 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت العصبي في إبرة نفاثة سائلة مكسورة بشكل صحيح باستخدام طرف تحميل الجل. قم بتحميل المحلول بالتساوي على الحافة بدون فقاعات. ثم أدخل الإبرة في حامل الماصة المتصل بجهاز المعالجة الدقيقة الآلي.

ضع غرفة التروية في محول غرفة دائرية على مرحلة المجهر. حرك المرحلة الآلية بحيث تكون اليرقة في وسط مجال الرؤية. بعد ذلك ، قم بتدوير محول الغرفة الدائرية بحيث يكون محور AP لليرقة محاذاة تقريبا مع مسار إبرة نفاثة السائل.

باستخدام الضوء المرسل وتباين التداخل التفاضلي ، قم بتركيز اليرقة وتوسيطها تحت هدف 10x. ثم ارفع هدف 10x. باستخدام أداة المعالجة الدقيقة الآلية ، قم بإحضار إبرة نفاثة السوائل إلى وسط مجال الرؤية ، بحيث تضيء بالضوء المرسل وبالكاد تلمس المخزن المؤقت العصبي.

قم بخفض هدف 10x للتركيز على اليرقة لتأكيد موقعها. ركز الهدف على إبرة النفاثة السائلة. حرك الإبرة النفاثة السائلة باستخدام المعالج الدقيق في المحاور x و y حتى تصبح في وضع مواز للجانب الظهري لليرقة.

بعد ذلك ، ركز مرة أخرى على اليرقة. اخفض الإبرة في المحور z ، وضع الإبرة على طول الجانب الظهري للسمكة ، على بعد 1 ملم من الجسم. حرك محول الغرفة الدائرية بعناية للتأكد من محاذاة إبرة النفاثة السائلة على طول خط الوسط AP لليرقة.

بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى هدف الماء 60x. تأكد من أن الهدف مغمور في المخزن المؤقت العصبي. استخدم التركيز الدقيق لتحديد موقع الصاري العصبي. بعد ذلك ، حرك المرحلة الآلية لوضع الصاري العصبي محل الاهتمام في وسط مجال الرؤية.

احتفظ بطرف الإبرة النفاثة السائلة على طول الجانب الظهري للسمكة. لا تلمس طرف إبرة نفاثة السائل إلى اليرقة أو سطح الغرفة. ضع الإبرة النفاثة السائلة مع المعالج الدقيق بحيث تكون على بعد 100 ميكرومتر من الحافة الخارجية للصاري العصبي.

ثم ركز على أطراف حزم الشعر القمي. يجب أن يكون الجزء السفلي من الإبرة النفاثة السائلة في بؤرة التركيز في هذه المستوى. اضبط مشبك الضغط عالي السرعة من الوضع اليدوي إلى الوضع الخارجي لتلقي المدخلات من برنامج التصوير. قم بتصفير مشبك الضغط عالي السرعة بالضغط على زر الصفر ، واستخدم مقبض نقطة الضبط لضبط ضغط الراحة إيجابيا قليلا. قم بتأكيد إخراج الراحة لمشبك الضغط عالي السرعة باستخدام مقياس ضغط PSI متصل بإخراج مرحلة الرأس.

لتحديد الضغط اللازم لتحفيز حزم الشعر ، قم بتطبيق محفز اختبار بإخراج 0.125 و 0.25 فولت لمدة 200 إلى 500 مللي ثانية. لكل محفز اختبار ، قم بقياس مسافة انحراف أطراف حزم الشعر (kinocilia). اختر ضغطا يحرك الحزم لمسافة 5 ميكرومتر تقريبا. تأكد من أن أطراف kinocilia تظل في بؤرة التركيز طوال الوقت.

للحصول على صور أحادية المستوى ، حدد حافزا لتسليمه أثناء الحصول على 80 إطارا بعد الإطار 30 في ثلاث ثوان. لقياس استجابات الكالسيوم الحساسة للميكانيكا ، ركز على قاعدة حزم الشعر القمي وابدأ في الحصول على الصورة. لقياس استجابات الكالسيوم قبل المشبكي ، ركز على قاعدة خلايا الشعر وابدأ في الحصول على الصورة.