تطوير نموذج من جانب واحد lesioned الفأر 6 OHDA من مرض باركنسون

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نموذج فأر مصاب بمرض باركنسون. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير الأدوية للجراحة أولاً، ثم إعداد الجهاز الجراحي، وبعد ذلك يتم إجراء جراحة لإحداث آفة أحادية الجانب باستخدام مادة six hydroxy dopamine، مع اتباع الرعاية المناسبة بعد العملية الجراحية.

يمكن استخدام الحيوانات الستة التي أُحدثت لها إصابة بـ hydroxy dopamine في التجارب السلوكية. وفي النهاية، تُظهر النتائج استنزافاً للدوبامين بنسبة تزيد عن 95% في الحزمة الدماغية الإنسية من جانب واحد. إن أهم جانبين في هذا الإجراء يجب على الأفراد الانتباه إليهما هما أولاً الرعاية المناسبة بعد الجراحة لضمان بقاء الحيوانات على قيد الحياة.

وثانياً، يجب العناية بتجهيز المعدات اللازمة لتسريب الـ six hydroxy dopamine لضمان إيصال السم العصبي بشكل كامل. لبدء هذا الإجراء، قم بتعقيم الأدوات الجراحية في جهاز التعقيم (autoclave). بعد ذلك، قم بتنظيف جميع الأسطح والمعدات باستخدام كحول الإيزوبروبيل.

بعد ذلك، قم بالتحضير لمرحلة ما بعد الجراحة من خلال تجهيز قفص تعافي للفئران مع وضع مناشف ورقية في قاعدته. ضع القفص تحت مصباح تدفئة أو فوق وسادة تدفئة لتجهيز عربة التخدير. تأكد من أن تدفق الأكسجين متصل ومفتوح، وأن خزان isof fluorine ممتلئ تماماً.

بعد ذلك، اضبط تدفق الأكسجين على 1% والـ isof fluorine على 2 إلى 4%. الخطوة التالية هي تجميع جهاز التسريب. قم بتركيب صامولة معدنية واحدة من نوع RN على أحد جانبي أنبوب peak، يليها سدادة peak cup feral. ثم ركب سدادة PFA canonical، ووجه السدادات بحيث ينزلق المخروط الموجود في سدادة PFA canonical داخل الجزء المقابل من سدادة peak cup feral.

بعد ذلك، ضع كوب القمة المزدوج وقطعة PFA feral القياسية في أي من طرفي وصلة RN ذات المحور الصغير المزدوج، ثم أحكم ربط صامولة RN المعدنية الموجودة في الطرف الآخر من وصلة RN ذات المحور الصغير المزدوج. أدخل إبرة حقن بمقياس 33. مرر الإبرة عبر إحدى صواميل RN المعدنية وأحكم ربطها.

تأكد من أن الإبرة ذات القياس 33 gauge تقع بزاوية 180 درجة بالنسبة للموصل RN ثنائي السرة الصغير. بعد ذلك، قم بتركيب إحدى صواميل RN المعدنية في الطرف الآخر من أنبوب peak، يليه حلقة peak cup feral. ثم قم بتركيب حلقة PFA feral في الأخدود الأعمق للموصل RN ثنائي السرة الصغير الثاني، وأحكم ربط صامولة RN المعدنية لتأمين الاتصال.

بعد ذلك، وفي الطرف الآخر من الموصل المزدوج الصغير الثاني لمحور RN، أدخل وصلة الجذب (lure) في محول محور RN الصغير، ثم أحكم ربط صامولة RN المعدنية الخاصة بوصلة الجذب لتأمين الاتصال. وبذلك يكتمل إعداد جهاز التسريب. وتتمثل الخطوة التحضيرية التالية في تهيئة جهاز التسريب.

أولاً، املأ محاقن هاميلتون بسعة 250 µL و1 µL بالماء المعقم، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هوائية. ثم قم بتوصيل المحقنة بسعة 250 µL بالمحول اللولبي (lure adapter)، واضغط على مكبس المحقنة بسعة 250 µL بحيث يتم دفع الماء عبر إبرة الحقن ذات القياس 33 gauge الموجودة في الطرف الآخر من الأنبوب.

استمر في دفع الماء عبر النظام أثناء سحب سرنجة الـ 250 µL من محول الطُعم. مع ترك قطرة صغيرة من الماء على طرف محول الطُعم، اضغط على مكبس سرنجة الـ 1 µL حتى يتم طرد قطرة صغيرة من الماء. بعد ذلك، أدخل سرنجة الـ 1 µL بعناية في محول الطُعم.

تأكد من اتصال قطرة الماء الموجودة في سرنجة الـ 1 µL بقطرة الماء الموجودة في محول الطُعم. بعد ذلك، أدخل سرنجة الـ 1 µL بالكامل في محول الطُعم وتأكد من عدم وجود فقاعات في وصلة الموزع المزدوج RN الصغيرة. الآن، قم بتثبيت جهاز التروية في الإطار التجسيمي، وباستخدام مشبك مضخة التسريب، ثبت وصلة الموزع المزدوج RN الصغيرة مع إبرة الحقن عيار 33 gauge في ذراع التحكم الخاصة بالإطار التجسيمي.

ثم قم بتثبيت محقنة سعة 1 µL في مضخة التروية. بعد ذلك، قم ببرمجة مضخة التسريب للسماح بمعدل تسريب قدره 0.1 µL/min، وذلك قبل 30 دقيقة من العملية. زن الحيوان وسجل وزنه.

قم بحقن الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق بمزيج يتكون من 2.5 mg/mL من dopamine hydrochloride و0.5 mg/mL من parline hydrochloride بجرعة 10 mL/kg. بعد ذلك، ضع قرص تسخين دافئ تحت قضبان الأذنين وقضيب القواطع للحفاظ على درجة حرارة الحيوان أثناء الجراحة، واضبط الحيوان على الارتفاع المثالي ليتناسب مع قضبان الأذنين والقواطع في الجهاز التجسيمي (stereotaxic frame) بعد 15 دقيقة من حقن مزيج dopamine hydrochloride وparline hydrochloride.

ضع الفأر في غرفة مغلقة مخصصة للتشنجات. قم بتخدير الحيوان عن طريق استنشاق isof fluorine. يُعتبر الحيوان مخدراً بشكل كافٍ عندما لا يُظهر أي استجابة لقرص الطرف الخلفي ولا يظهر عليه منعكس الرمش.

بعد ذلك، قم بحلاقة الجزء العلوي من رأس الفأر. وفي هذه المرحلة، ضع الفأر في الإطار التجسيمي (stereotaxic frame). ثم ضع قضيب القواطع في فمه وقناع التخدير فوق وجهه.

ثم قم بضبط معدل تدفق الـ isof fluorine. ضع المخدر الموضعي lidocaine مباشرة على الجلد باستخدام القطن. اضبط قضيب القواطع وأكواب الأذن لمساواة الجزء العلوي من الجمجمة.

بعد ذلك، يتم تعقيم الجلد باستخدام محلول Betadine. ثم يتم إدخال أكواب الأذن. وتكون أكواب الأذن قد أُدخلت بشكل صحيح عندما يكون الرأس مسطحاً تماماً ولا يمكن تحريكه في أي من الاتجاهين.

بعد ذلك، يتم القص على طول الخط الناصف للرأس باستخدام شفرة مشرط وإزاحة الجلد. جفف سطح الجمجمة باستخدام قطعة شاش. اضغط على مكبس محقنة سعة 1 µL وضع إبرة الحقن ذات القياس 33 gauge في أنبوب سعة 1 mL يحتوي على 15 mg/mL.

محلول six hydroxy dopamine مغطى بورق القصدير. اسحب المكبس ببطء مع إبقاء إبرة الحقن عيار 33 مغمورة في محلول six hydroxy dopamine. بعد ذلك، وجه طرف إبرة الحقن نحو B bgma، وقم بصرف كمية صغيرة من محلول six hydroxy dopamine لتكوين قطرة صغيرة.

بعد ذلك، قم بخفض طرف إبرة الحقن ببطء. عندما تلامس الخرزة bgma، توقف عن دفع الإبرة وسجل هذه الإحداثيات. اسحب إبرة الحقن بمقدار مليومترين في الاتجاه الظهري وتحرك على طول الدرز السهمي في اتجاه منقاري نحو Lambda.

عندما تكون الإبرة فوق Lambda، قم بتفريغ كمية صغيرة من محلول six hydroxy dopamine من إبرة الحقن لتشكيل قطرة صغيرة. ثم اخفض طرف الإبرة ببطء نحو lambda. وعندما تلامس القطرة Lambda، توقف عن تحريك الإبرة للأمام وسجل هذه الإحداثيات.

يجب أن تكون إحداثيات الإنسي-الوحشي والظهري-البطني متطابقة لكل من BMA وLambda. وفي حال عدم تطابقها، يتم ضبط قضيب القواطع وفقاً لذلك. وبالنسبة لإحداثيات الأمامي-الخلفي وقضبان الأذن لإحداثيات الإنسي-الوحشي، يتم تحريك الإبرة إلى إحداثيات الحقن.

AP ناقص 1.2 مليمتر، ML ناقص 1.1 مليمتر بالنسبة إلى bregma. يتم توزيع كمية صغيرة من المحلول من إبرة الحقن لتكوين قطرة صغيرة. يتم وضع القطرة الصغيرة على الجمجمة لتحديد الموقع الذي سيتم ثقبه. بعد ذلك، يتم سحب الإبرة، ثم يتم ثقب فتحة في الجمجمة باستخدام إبرة قياس 25.

أعد إبرة الحقن إلى إحداثيات الحقن، ثم أدخل الإبرة بمقدار خمسة مليمترات في الاتجاه الظهري البطني. بعد ذلك، قم بحقن 0.2 µL من 6-hydroxy dopamine أو المادة الناقلة (vehicle) أحادياً في الحزمة الدماغية الأمامية المتوسطة بمعدل 0.1 µL في الدقيقة. وعند الانتهاء من إعطاء 6-hydroxy dopamine أو المادة الناقلة، اترك الإبرة في مكانها لمدة خمس دقائق أخرى للسماح بالانتشار من موقع الحقن.

بعد ذلك، اسحب الإبرة ببطء، وأغلق الشق في فروة الرأس باستخدام ثلاث غرز، ثم احقن 1 mL من محلول رينجر اللاكتات تحت الجلد. وأخيرًا، أخرج الحيوان من الإطار التجسيمي وضعه في قفص التعافي حتى يستعيد وعيه. من 15 إلى 21 يومًا بعد جراحة إصابة الـ six hydroxy dopamine.

عندما يكتمل مقدار موت الخلايا الناجم عن السم العصبي، يمكن قياس الدورانات التلقائية بزاوية 360 درجة لتقييم نجاح عملية الآفة الناجمة عن six hydroxy dopamine. وفي هذا التقييم السلوكي، تظهر الفئران التي تعاني من استنفاد الدوبامين الناجم عن six hydroxy dopamine بنسبة تزيد عن 95% دورانات عكسية IP أكبر بكثير من الفئران التي خضعت لآفة جزئية بـ six hydroxy dopamine أو التي خضعت لعملية وهمية. ومن خلال ربط مستويات SAL dopamine بنسبة الدورانات العكسية IP التلقائية في كل حيوان، وُجد أن الفئران التي أظهرت دورانات عكسية IP بنسبة 70% أو أكثر مع آفة six hydroxy dopamine قد فقدت أكثر من 95% من Sal dopamine.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية إجراء عملية تلف كيميائي دقيقة باستخدام 6-hydroxy dopamine في الفئران، وذلك عبر التوجيه التجسيمي والتحكم في معدل التسريب. سيؤدي ذلك إلى استنزاف الدوبامين بنسبة تزيد عن 95%. كما يجب أن تلم بكيفية إجراء التقييم السلوكي لمرض باركنسون في الفئران.