توصيف الوصلات العصبية العضلية في الفئران عن طريق الفحص المجهري المشترك متحد البؤر والفائق الدقة

ابدأ بألياف عضلات الفئران الثابتة كيميائيا والمتنفذة كيميائيا الموضوعة في آبار صفيحة متعددة الآبار.

احتضن في محلول مانع لتقليل ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.

أضف الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف بروتينا قبل المشبكي معبرا عنه عند الوصلة العصبية العضلية أو NMJ.

يغسل بمحلول عازل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور التي تستهدف الأجسام المضادة الأولية ، والسموم العصبية المترافقة بالفلوروفور التي ترتبط بمستقبلات الأستيل كولين بعد المشبكي.

يغسل بمخزن مؤقت لإزالة الكواشف غير المرتبطة.

ضع الألياف على شريحة بوسائط تثبيت ، ضع غطاء ، وثبته بمغناطيس أسطواني لتسطيح الألياف.

ابدأ التصوير باستخدام مجهر CONFOCAL STED.

عند إضاءة الليزر ، تتألق البروتينات المسماة.

يفشل الفحص المجهري متحد البؤر في حل هياكل NMJ الدقيقة بوضوح بسبب دقته المحدودة وانتشاره الفلوري.

في المقابل ، يستخدم الفحص المجهري STED ليزر النضوب لقمع انتشار التألق ، مما يسمح بتصور NMJ واضح.

بعد القتل الرحيم ، ابدأ في مضايقة عضلات الظنبوب الأمامية في حزم ألياف صغيرة يبلغ عرضها حوالي 1 ملم باستخدام ملقطين مسنن دقيقين. ثم انقل حزم العضلات هذه إلى صفيحة مكونة من 24 بئرا تحتوي على 1٪ Triton X-100 محضرة في PBS ، واتركها تتحرك برفق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، أو خمس ساعات عند 4 درجات مئوية.

بعد غسل العينات ثلاث مرات لمدة 5 دقائق باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة ، احتضان العينات بمحلول مانع مكون من 4٪ BSA محضر في PBS مع 1٪ Triton X-100 لمدة أربع ساعات عند 4 درجات مئوية تحت تحريض لطيف. ثم احتضان العينات طوال الليل بنفس محلول الحجب الذي يحتوي على أجسام مضادة أولية وحيدة النسيلة ضد الخيوط العصبية M أو البروتين السكري الحويصلي المشبكي 2 لتسمية أطراف المحور العصبي قبل المشبكي أو المناطق النشطة على التوالي.

في اليوم التالي ، اغسل حزم العضلات المسمى ثلاث مرات لمدة 5 دقائق باستخدام PBS تحت تحريض لطيف. ثم احتضنها بأجسام مضادة ثانوية مناسبة عن طريق وضعها على شاكر لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل حزم العضلات مرة أخرى ، ضعها على شريحة ذات وسط تثبيت. ثم ضع غطاء زجاجي بدرجة 1.5 في الأعلى ، متبوعا بمغناطيس أسطواني على جانبي الشريحة للضغط وتسطيح العضلات.

للحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر ، قم بتشغيل برنامج المجهر واختر الآلة كوضع تكوين ، واجمع مجموعات الصور للوصلات العصبية العضلية في كل مجموعة تجريبية وفقا للإعدادات المذكورة في المخطوطة النصية. في نهاية الجلسة ، انقر فوق فتح في عارض 3D واختر مقاطعة عصبية عضلية ممثلة لمجموعة تجريبية لتصور الملصقات ثلاثية الأبعاد.