Name: الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: اكتشف طريقة فحص عالي الإنتاجية لتقييم إمكانية تحلل الكربوهيدرات في الكتلة الحيوية النباتية. تساعد هذه التقنية الباحثين على تحديد الأصناف المثلى لإنتاج الوقود الحيوي والمواد الكيميائية المتجددة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب وأود أن أشكر Viksø نيلسن (Novozymes) للهدية من الانزيمات cellulolytic. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل FP7 التجديد والمشاريع التي BBSRC BB/G016178 وBB/G016194.

1. تحضير عينات نحن نعمل عادة مع نابع إما من النباتات العشبية أو الخشبية. في حالة المواد العشبية التي تزرع النباتات لمرحلة النضج ، وبعد تطوير البذور الجافة التي نجمعها ينبع الشيخوخة حالما يكتمل. ومقطعة الى شرائح ينبع 4 ملم ، ووضعها في قارورة 2 مل مع كرات طحن الثلاثة. في حالة المواد الخشبية ، هي الأرض العينات الى نشارة الخشب الخشنة مع مسار ملف الخشب ومن ثم وضعها في طاحونة الكرة لمزيد من المعالجة. توضع العينات في رفوف داخل طحن / تنسيق محطة (الشكل 1). هذه المحطة يطحن بالتسلسل ، يمزج ، ويزن كل عينة. تم تأسيس عدد من التكرار المطلوبة لكل عينة عن طريق اختبار مواد الأرض في سلسلة من التجارب الأولية ، حيث يتم تحديد التباين الجوهرية لحجم الجسيمات معينة. واخترقت قارورة سعة 2 في القاع ، ويتم الاستغناء عن المواد التي اهتزاز القارورة أكثر من البئر المحدد. يتم التحكم في ذراع تهتز من ردود الفعل من رصيد يسمح لصرفها دقيقة من المسحوق. الروبوت يوزع 4 ملغ / جيد في التحليل القياسي وهناك حاجة إلى 4 التكرار في الحالات القصوى. هذا يسمح بتحليل عينات من النبات 20 / لوحة. 2. المعالجة مرة واحدة يتم تنسيق العينات ، يتم تجهيزها لوحات 96 - جيدا من قبل نظام تداول الآلي السائل (الشكل 2). هنا يتم تنفيذ المعالجة خفيفة على المواد النباتية من خلال إضافة 350 ميليلتر من حمض أو حلول القلوية والتدفئة لوحة على كتلة تكييفها. لتجنب التبخر خلال التحليل ، وأغلقت 96 لوحات جيدا مع مات السيليكون. يمكن تعديل درجة الحرارة ووقت المعالجة وفقا للمواد التي تجري دراستها. درجة الحرارة القصوى ، مع ذلك ، هي 100 درجة مئوية. إجراء بديل لاختبار أشد المعالجة المسبقة هو يمهد للمعالجة المواد خارج الخط ، والقضاء على pretreatmet من العملية. 3. تحليل بالماء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد المواد سابقة التجهيز ، والروبوت يزيل تلقائيا حل المعالجة ، ويغسل ، وجميع الآبار ، و 5 مرات مع 850 ميكرولتر 25 ملم مخزن خلات. يتم تنفيذ يشطف بها مضيفا العازلة في حل المعالجة ، وإزالة لاحقا 50 ٪ من حجم التداول الكلي بعد السماح للمواد الصلبة في العينة إلى تسوية. تم تعيين ذروة الطموح في نصف كتلة السائل لتجنب الشفط المواد الصلبة من قاع البئر ، وليس هناك خسارة ضئيلة من المواد الصلبة باستخدام هذا النهج. بعد هذه يغسل جيدا في درجة الحموضة 4.5 والمواد مستعد لالإنزيمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف خليط يحتوي على انزيم حل السليلوزات وhemicellulases بواسطة الروبوت. في كل بئر ، يتم الاستغناء عن 850 ميليلتر من مزيج الأنزيم ، وانتقل إلى لوحة حاضنة 50 درجة مئوية الهز. يتم تنفيذ التحلل القياسية لمدة 8 ساعات ، ولكن يمكن تكييف هذه المرة لغرض التجربة. التحميل انزيم القياسية المستخدمة في الأعشاب هو 7 FPU / غرام من المادة. </li></ol> 4. الكشف عن السكريات المختزلة تم تنفيذ التصميم للحد من السكريات أفرج عنه بعد التحلل باستخدام تعديل 3 - 2 - الميثيل benzothiazolinone hydrozone (MTBH) الأسلوب 3. وقد تم اختيار MBTH والأسلوب الأكثر مناسبة لأنه كان أسهل لأتمتة وأقل عرضة للتداخل من المركبات مثل البروتينات. نحن تعديل هذه الطريقة شديدة الحساسية للاستخدام على منصة الروبوت بحيث يمكن قياسها كميا بدقة في تركيزات السكريات الموجودة في hydrolysates الكتلة الحيوية ، مع حجم النهائي من 250 ميكرولتر الذي هو مناسبة ل96 لوحة ضوئية قياسية أيضا. يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية تلقائيا وتم تنفيذ ثلاثة قرارات مستقلة عن الحد من السكريات لكل فعل تسكر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقد التقطت 30 ميكرولتر من حلامة من لوحة البئر العميق ومختلطة مع 45 ميكرولتر من 25 ملم خلات الصوديوم العازلة في صفيحة متجنب 96 PCR جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم إضافة 25 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 1N و 50 ميكرولتر من محلول يحتوي على 0.43 ملغم / لتر و 0.14 MBTH DTT ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد خلط ، كانت ساخنة لوحة PCR عند 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في thermocycler أو جهاز مشابه يسلم بالضبط نفس الكمية من الحرارة إلى جميع الآبار 96. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ونقل ردود الفعل الناتجة إلى لوحة ضوئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من كاشف المؤكسدة (0.2 ٪ FeNH4 (SO4) 2 ، حامض Sulfamic 0.2 ٪ و 0.1 ٪ حمض الهيدروكلوريك). تخلط جيدا وتترك لتطوير ما لا يقل عن 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب على كل لوحة تحتوي أيضا على مستوى ردود الفعل nmol 50 ، 100 و 150 nmol nmol الجلوكوز. قراءة في لوحات ضوئية 620 نانومتر. </li></ol> 5. ممثل النتائج : وتعرض أمثلة على أنواع مختلفة من التحليلات في الشكل 3 و 4. تم الحصول على جميع النتائج باستخدام منصة الآلي. الشكل 3 إعادةويعرض زيادة في الحد من السكريات اصدره حضانات ح 8 من الحور الأرض مع كميات متزايدة من الانزيمات cellulolytic. الشكل 4 يقدم آثار الحمضية والقلوية المعالجة على عينات الحور. هيدروكسيد الصوديوم في المعالجة هي أكثر كفاءة من أن تضعف H2SO4 المعالجة في تسهيل الافراج عن السكريات خلال التحلل. وتقاس كمية من السكريات بعد التحلل النقصان عندما يتم تنفيذ المعالجة باستخدام تركيزات أعلى من هيدروكسيد الصوديوم 1M. <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. محطة الروبوتية لطحن و 96 تنسيق جيد من الكتلة الحيوية <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. محطة مناولة السائل لتحليل الإنتاجية العالية تسكر <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. تأثير أحمال مختلفة على انزيم الافراج عن تخفيض حكمه السكر من عينات الحور <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="الشكل 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 4"> الشكل 4. تأثير المعالجة المسبقة المختلفة على عينات من الحور تسكر. السكريات ألف أفرج عنه بعد pretreament مع نسب مختلفة من H2SO4 عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. السكريات باء أفرج عنه بعد المعالجة المسبقة هيدروكسيد الصوديوم في نفس درجة الحرارة والوقت من حمض المعالجة .

<ol><li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Physiol+Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li>
<li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass%3A+the+writing%27s+on+the+walls%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li>
<li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li>
<li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li>
</ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

يمكن استخدام تنويعات من بروتوكول التكسير السكري القياسي في المنصة ذاتها لتحديد نشاط الإنزيمات المحللة للسليلوز (على سبيل المثال، من خلال تغيير تركيزات الإنزيمات المستخدمة في الطبق، أو استخدام الورق كركيزة)؛ ومقارنة كفاءة عدة مخاليط إنزيمية على مادة محددة؛ وتحديد المجرى الزمني للتكسير السكري؛ وما إلى ذلك.
يتضمن بروتوكول التكسير السكري القياسي لمقارنة إمكانات التكسير السكري في مواد نباتية مختلفة عملية تحلل مائي لمدة ثماني ساعات (الشكلان 3 و 4). تتطلب معظم المواد النباتية التي تم تحليلها أربع مكررات. وتحت هذه الظروف، يمكن للمنصة معالجة 80 عينة/يوم. ويُستخدم هذا التحليل لفحص مجموعات كبيرة من الشعير والذرة والبراديبوديوم (brachypodium) من أجل تحديد التباين في إمكانات التكسير السكري والجينات المشاركة في تحديدها4.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> طحن ويزن الروبوت </td><td> Labman أتمتة </td><td></td></tr><tr><td> 2 مل الأنبوب الصغير مع قبعات </td><td> Sarstedt المحدودة </td><td> 72.694 </td></tr><tr><td> 5 ملم حبات الفولاذ المقاوم للصدأ </td><td> Qiagen المحدودة </td><td> 69989 </td></tr><tr><td> 1.2ml Abgene مربع لوحات تخزين جيد </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> طولكرم - 050 - 050C </td></tr><tr><td> Whatman حصيرة سقف لوحات جيدا مربع 96 </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> 7704-0104 </td></tr><tr><td> السائل hanling الروبوت </td><td> Tecan المجموعة المحدودة </td><td> الحرية ايفو 200 </td></tr><tr><td> حمض الكبريتيك </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> S/9231/PB17 </td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> BPE359 - 500 </td></tr><tr><td> خلات الصوديوم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S8750 - 500G </td></tr><tr><td> حامض الخليك </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> A/0420/PB17 </td></tr><tr><td> Novozyme 188 </td><td> Novozyme </td><td> DCN00214 </td></tr><tr><td> Celluclast 1.5L </td><td> Novozyme </td><td> CCN03122 </td></tr><tr><td> 96 كذلك لوحات PCR تنورة كامل </td><td> Sarstedt المحدودة </td><td> 72.1980.202 </td></tr><tr><td> D - غلوكوز </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> G/0450/53 </td></tr><tr><td> 3 - 2 - الميثيل benzothiazolinone هيدرات هيدرازون هيدروكلوريد </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 129739 - 25G </td></tr><tr><td> DL - dithiothreitol </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D9163 - 1G </td></tr><tr><td> كورنينج microplate 96 مسطحة القاع جيدا </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> TKT - 521 - 050H </td></tr><tr><td> dodecahydrate الامونيوم سلفات الحديد (III) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> F1668 - 250G </td></tr><tr><td> Sulfamic حمض </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 242772 - 500G </td></tr><tr><td> حامض الهيدروكلوريك </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> 12462-0026 </td></tr></tbody></table>

الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر lignocellulosic

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

ويمكن تقسيم السكريات التي تشكل الكتلة الحيوية النباتية lignocellulosic وصولا الى انتاج مجموعة من السكريات التي يمكن استخدامها لاحقا في إنشاء معامل تكرير أحيائية. وهذه الخامات تشكل منصة الصناعية الجديدة ، وهما أمران غير المستدامة ومحايدة الكربون ، لتحل محل الاعتماد الحالي على الوقود الأحفوري. تنتج تمردات لتفكيك المواد التي لوحظت في الخصائص الذاتية التي lignocellulosic العديد من جدران الخلايا النباتية. السليلوز البلورية مضمن في مصفوفة مثل السكريات وxylans arabinoxylans ، والهيكل كله المغطى من قبل الفينولية البوليمر اللجنين ، وهذا هو أيضا صعبة الهضم 1. من أجل تحسين هضم المواد النباتية نحن بحاجة لاكتشاف الاختناقات الرئيسية لتسكر من جدران الخلايا ومتحولة أيضا شاشة تربية والسكان لتقييم التغير في تسكر 2. هذه المهام تتطلب نهجا إنتاجية عالية ، وهنا نقدم منصة التحليلية التي يمكن القيام بتحليل التسكير في شكل لوحة 96 - جيدا. وقد تم تطوير هذا النظام الأساسي للسماح للفحص هضم lignocellulose أعداد كبيرة من السكان من الأنواع النباتية المختلفة. وقلصت نحن باستمرار حجم رد فعل لمعالجة مسبقة لطيف ، الإنزيمية جزئية والتصميم والسكر ، والسماح لأعداد كبيرة بسرعة المقررة في النظام الآلي. هذا البرنامج يعمل آليا مع كميات مليغرام من الكتلة الحيوية ، وأداء طحن الكرة في ظل ظروف خاضعة للرقابة للحد من المواد النباتية إلى حجم الجسيمات بطريقة موحدة استنساخه. مرة واحدة على عينات من الأرض ، والروبوت الآلي التنسيق يوزع كميات محددة من المواد وسجلت في المقابل من الآبار بئر عميقة لوحة 96 (الشكل 1). عادة ، ونحن الاستغناء عن نفس المادة الى 4 آبار لدينا 4 يعيد للتحليل. مرة واحدة تملأ اللوحات مع المواد النباتية في التخطيط المطلوب ، يتم نقل يدويا لأنها محطة معالجة السائل (الشكل 2). في هذه المحطة التي يتعرض لها عينات إلى المعالجة إما خفيفة مع حمض مخفف أو القلوية وحضنت في درجة حرارة تصل إلى 90 درجة مئوية. بعد ذلك تتم إزالة الحل المعالجة وتشطف العينات مع عازلة لإعادتهم إلى درجة الحموضة مناسبة للالمائي. ثم يتم تحضين العينات مع مزيج الانزيم لفترة من الزمن المتغير عند 50 درجة مئوية. يؤخذ على قسامة من حلامة تلقائيا ، ونحن مصممون على خفض السكريات الأسلوب MBTH اللونية.

يوصف بسيطة ، طريقة سريعة لتحديد إمكانية تسكر أعداد كبيرة من عينات الكتلة الحيوية النباتية. النظام الأساسي لهذا التحليل الآلي ينطوي على إعداد الكتلة الحيوية النباتية للتحليل في 96 لوحات جيدة وأداء لاحقة من التحلل ، المعالجة وتقدير من السكريات الافراج عنهم.

الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic

يمكن تفكيك السكريات المتعددة التي تشكل الكتلة الحيوية اللجنو-سليلوزية النباتية لإنتاج مجموعة من السكريات التي يمكن استخدامها لاحقاً في تأسيس...

مرحباً، أنا كارا تيد، وأنا ليو. أنا هنا. وأنا سايمون ماكوين ميسون.تعد قابلية هضم الكتلة الحيوية النباتية موضوعاً يحظى باهتمام كبير في الوقت الحالي. ويرجع ذلك إلى وجود كميات كبيرة من السكريات المرتبطة بالبولي سايكاريدات الموجودة في جدران الخلايا النباتية التي تشكل هذه الكتلة الحيوية، وإذا تمكنا من استخلاص تلك السكريات بشكل قابل للاستخدام، فيمكننا تخميرها لإنتاج أنواع مختلفة من المنتجات مثل الوقود والمواد الكيميائية. ولسوء الحظ، فإن هذه المواد يصعب هضمها للغاية، لذا فإن التوصل إلى فهم أفضل للعوامل التي تتحكم في هذه القابلية للهضم هو أمر ملح.لكي نتمكن من استخدام المواد النباتية لإنتاج مجموعة التجديد، نحتاج إلى القدرة على قياس إمكانية التكسير السكري في هذه النباتات. لذا، نقوم هنا في جامعة يورك بفحص مجموعات كبيرة من المواد النباتية لتحديد إمكانية التكسير السكري لديها. والتكسير السكري هو عملية تكسير الكربوهيدرات المعقدة إلى مكوناتها من السكريات الأحادية لإنتاج مواد كيميائية قيمة عبر عمليات صناعية مختلفة.لقياس إمكانات التسكير، نقوم بمحاكاة العمليات الصناعية على نطاق مجهري، حيث نخضع الكتلة الحيوية لمعالجة أولية وتحلل إنزيمي لتحديد السكريات المتحررة. يساعد ذلك في تحديد الأصناف الواعدة ضمن الأنماط الجينية. يعمل نظام الإنتاجية العالية بتنسيق لوحة IG ذات الستة آبار.تُستخدم ظروف تحلل مائي خفيفة لإظهار الفروق الدقيقة بين الأنماط الجينية، كما أنها مرنة بما يكفي لدعم مواد ركيزة مختلفة بالإضافة إلى تقييم إنزيمات متنوعة. تتضمن الطريقة التي نستخدمها تحويل المادة النباتية إلى مسحوق، ثم تتم معالجتها مسبقاً بحمض أو مادة قلوية مخففة عند 90 درجة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، يتم إجراء هضم إنزيمي باستخدام خليط سليلوز تجاري عند 50 درجة لمدة ثماني ساعات.أخيرًا، تُستخدم طريقة MBTH لتقدير تحرر السكريات المختزلة. يتم حصاد المادة النباتية على شكل سيقان جافة، والتي تُقطع إلى قطع بطول 4 mm. وتوضع هذه القطع في أنابيب سعة 2 mL مع ثلاث كرات معدنية بقطر 5 mm.يتم وضع ملصقات تحتوي على رموز شريطية (barcodes) على القوارير بشكل فردي، والتي يتم مسحها ضوئياً لضمان تتبع العينات. تُحمّل العينات في روبوتات الطحن والتنسيق داخل الروبوتات. يتم طحن العينات وخلطها تلقائياً للسماح بتوزيع الكتلة الحيوية في طبق يحتوي على 96 بئراً.يتم ثقب القوارير، ثم يُعاد وضع القارورة في الذراع الروبوتية بحيث تستقر داخل قمع يهتز لصرف المسحوق. ويتم تنظيم اهتزاز القمع بواسطة ميزان لتحقيق الكمية المستهدفة من الكتلة لكل بئر يتم صرفها. يتم توزيع الكتلة الحيوية في 10 أعمدة من الأطباق، مع ترك عمودين للمعايرات.من خلال إجراء أربع مكررات لكل عينة، نقوم بتحميل 20 عينة في كل لوحة. ثم يتم تقسيم ناتج التحلل المائي لهذه اللوحة إلى ثلاث مكررات في لوحات PCR، مما ينتج عنه ثلاث لوحات ضوئية. وبهذه الطريقة، نحصل على ثلاث تقديرات للسكريات المختزلة لكل بئر من الكتلة الحيوية.بمجرد التنسيق، يتم إغلاق الأطباق باستخدام حصيرة سيليكون لمنع التبخر. وعندما تصبح جاهزة، تُنقل إلى روبوت مناولة السوائل. وفي روبوت مناولة السوائل، يتم إجراء المعالجة الأولية، والتحلل الإنزيمي، وتحديد السكريات المتحررة بشكل آلي.تحتوي الطاولة التي يبلغ طولها مترين على أوعية للكواشف المختلفة المطلوبة، بالإضافة إلى مساحة لتخزين الأدوات البلاستيكية. وتوجد حاضنات للمعالجة المسبقة والتحلل المائي، بالإضافة إلى أجهزة التدوير الحراري لتقدير السكر. وتتم عملية المعالجة المسبقة في طبق الآبار العميقة.عن طريق إضافة محاليل حمضية أو قلوية مخففة إلى مسحوق الكتلة الحيوية. تُنقل الأطباق إلى الكتلة التسخينية وتُحضن عند 90 درجة لمدة 20 دقيقة. وعند انتهاء هذه الحضنة، يتم إزالة المعالجة المسبقة عن طريق الشطف خمس مرات باستخدام 500 µL من محلول acetate buffer.بمجرد شطف المعالجة المسبقة، يُضاف مزيج إنزيمي. وهو خليط قياسي، يحتوي على السليلوز وnovozyme 1, 8 8 بنسبة أربعة إلى واحد وبتركيز 7 FPU لكل بئر.تُحضن الأطباق لمدة ثماني ساعات عند 50 °C مع الرج. يُنقل 75 µL من الناتج المائي الناتج إلى طبق PCR. وفي العمودين 11 و12 من أطباق PCR، تُضاف معايير الجلوكوز.بعد ذلك، يتم إضافة 25 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 M إلى جميع الآبار. وأخيرًا، يتم نقل 50 µL من كاشف MBTH إلى طبق PCR. يتم تخزين طبق الآبار العميقة بعد الانتهاء من نقل ناتج التحلل المائي إلى طبق PCR الثالث.بينما تُنقل أطباق PCR إلى أجهزة التدوير الحراري للتحضين عند 60 درجة لمدة 15 دقيقة. وتتمثل الخطوة النهائية من العملية في نقل مزيج التفاعل إلى أطباق بصرية لظهور اللون. وبعد التحضين، تُزال أطباق PCR من جهاز التدوير الحراري.يتم إضافة 100 µL من كاشف الأكسدة إلى خليط التفاعل المنقول. ولتسهيل ظهور اللون، تُكرر عملية مناولة السوائل أربع مرات خلال 24 ساعة، حيث تستغرق مرحلة شطف المعالجة المسبقة وإضافة الإنزيم نحو ساعتين. وتستغرق عملية التحلل الإنزيمي ثماني ساعات، بينما يستغرق تقدير السكر ساعتين إضافيتين.بينما تخضع اللوحة الأولى للتحضين لمدة ثماني ساعات، تبدأ اللوحة التالية في العملية. ومن خلال هذا التخصيص لموارد الروبوت، يتم تحقيق إنتاجية قدرها 80 عينة يومياً لتحديد كمية السكريات المختزلة المتحررة. وتُقاس اللوحات الضوئية عند 620 nanometers.تُحلل النتائج التي يتم الحصول عليها لتقدير كمية السكريات المتحررة بوحدة نانومول لكل مليغرام لكل ساعة من التفاعل. شكراً لمتابعتكم، وآمل أن يلهم هذا بحثكم في مجال الوقود الحيوي.

high-throughput-saccharification-assay-for-lignocellulosic-materials

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

الكتلة الحيوية النباتية هي كبيرة خالية من الكربون الموارد المتجددة التي يمكن استخدامها لانتاج الوقود الحيوي. الكتلة الحيوية النباتية يتكون أساسا من جدران الخلايا ، والمواد المركبة المعقدة هيكليا ووصف lignocellulosics. نحن هنا وصف بروتوكول لإجراء تحليل شامل للمحتوى الكربوهيدرات وتكوين جدار مشتقة.

التركيبية تحليل شامل لجدران الخلايا النباتية (الكتلة الحيوية Lignocellulosic) الجزء الثاني : الكربوهيدرات

يصف هذا البروتوكول شاشة إنتاجية عالية للنشاط cellulolytic من مكتبة metagenomic أعرب في القولونية. الشاشة هو حل قائم ومؤتمتة للغاية ، ويستخدم واحد في 384 وعاء الكيمياء microplates جيدا مع قراءات النهائي باعتبارها قياس الامتصاصية.

شاشة إنتاجية عالية للنشاط Biomining سلولاز من مكتبات Metagenomic

وصفنا منخفضة التكلفة ، وأسلوب إنتاجية عالية للكشف عن النشاط endoglucanase الفطرية...

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

يوضح هذا الفيديو فحصا لفحص الإنزيمات الفعالة في تحطيم السكريات المعقدة في الكتلة الحيوية النباتية باستخدام الكتلة الحيوية الملونة غير القابلة للذوبان أو ICB. تقوم الإنزيمات بتحلل ICB لإطلاق السكريات قليلة السكاريد المرتبطة بالصبغة القابلة للذوبان ، ويتم تقييم نشاط الإنزيم عن طريق التحليل اللوني لمنتج التفاعل.

فحص الإنزيم القائم على الكتلة الحيوية الكروموجينيك غير القابل للذوبان: اختبار لتقييم نشاط التحلل للإنزيمات المهينة للكتلة الحيوية النباتية

يمكن جمع النفايات الصناعية وتعديلها لتحليل النمو الميكروبي. توفر تقنيات استخراج اللجنوسليلوز مكونات لتحليل قدرة التحلل البيولوجي المحددة. يحدد قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا الغازية منتجات التخمير للكائنات الحية الدقيقة المزروعة على نفايات اللب. تحدد هذه الطرق القدرة الأيضية للكائنات الحية الدقيقة على تحلل نفايات اللب.

طرق لتسهيل النمو الميكروبي على اللب مطحنة النفايات تيارات وتوصيف إمكانات التحلل الحيوي من الميكروبات مثقف

يتم تقييم هيكل جدار الخلية النباتية وسمات الكيمياء لتحديد المواد الأولية المثالية للوقود الحيوي والمواد الحيوية. الطرق القياسية لها قيود عند تطبيقها على مجموعات البيانات الكبيرة. تقارن طرق المعالجة المسبقة عالية الإنتاجية ، وتكسير الإنزيم ، وقياس الطيف الكتلي للحزمة الجزيئية للانحلال الحراري أعدادا كبيرة من عينات الكتلة الحيوية مع انخفاض الوقت والتكلفة التجريبية.

الإنتاجية العالية فحص الاختلافات الإستعصاء في Lignocellulosic الكتلة الحيوية: إجمالي اللجنين، اللجنين مونمرات، والأنزيمية السكر الإصدار

نقدم طريقة معيارية آلية عالية الإنتاجية لتحديد وتوصيف عديد السكاريد الميكروبي على نطاق صغير. تجمع هذه الطريقة بين الاختيار المسبق السريع لتحليل الكمية الإجمالية للسكريات المفرزة مع بصمة الكربوهيدرات التفصيلية لتمكين الفحص السريع للسلالات البكتيرية المعزولة حديثا أو مجموعات السلالات الكاملة.

الآلي وحدات إنتاجية عالية Exopolysaccharide فحص منصة مقرونا حساسة للغاية تحليل الكربوهيدرات بصمات الأصابع

ووصف تقنيات التطور والعزلة على التكيف وأظهرت لانتاج مشتقات سلالة Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 التي تكون قادرة على تستهلك بسرعة هيكسوز والسكريات مختلطة البنتوز في انزيم saccharified hydrolyzates undetoxified وتتراكم أكثر من 40 جم / لتر من الإيثانول.

تقنيات لتطور قوية خميرة تخمر البنتوز للالتحويل البيولوجي من مادة الخشب إلى إيثانول

يتم عرض المعالجة المسبقة للكتلة الحيوية اللجنوسليلوزية بالسوائل الأيونية منخفضة التكلفة البروتينية ، مما ينتج عنه لب غني بالسليلوز واللجنين المنقى. يؤدي اللب إلى ارتفاع إنتاجية الجلوكوز بعد التكسير الأنزيمي.

المعالجة من Lignocellulosic الكتلة الحيوية مع منخفضة التكلفة أيوني السوائل

يتم وصف مقايسة عالية الإنتاجية لفحص الإنزيم. تتكون مجموعة الفحص الجاهزة للاستخدام متعددة الإرسال هذه من ركائز Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) المختارة مسبقا وركائز الكتلةB الهرومولينية Cالمعقدة I (ICB). الإنزيمات المستهدفة هي الإنزيمات الداخلية والبروتياز المتحلل للسكاريد.

فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

OrganoCat هو وسيلة لpretreatment و تقسيم lignocellulose في ظل ظروف معتدلة في اللجنين والسكريات القابلة للتخمير ، ولب السليلوز. في نظام مذيب حيوي ثنائي الطور من الماء و2-ميثيلتيتراهيدروفوران مع حمض 2,5-furancarboxylic كمحفز ، يتم فصل منتجات OrganoCat في الموقع لاستعادة المنتج مباشرة.

تجزئة الكتلة الحيوية الليجنوسيلولوسية باستخدام عملية أورجانوكات

اكتشف طريقة فحص عالي الإنتاجية لتقييم إمكانية تحلل الكربوهيدرات في الكتلة الحيوية النباتية. تساعد هذه التقنية الباحثين على تحديد الأصناف المثلى لإنتاج الوقود الحيوي والمواد الكيميائية المتجددة.

الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic

استكشف المزيد من الفيديوهات