في الجسم الحي التصوير المزدوج الركيزة Bioluminescent

يُستخدم هذا الإجراء لتصوير وقياس كمية لوسيفيريز رينيا ولوسيفيريز اليراعة. عند تطوير أورام متعامدة في الجسم الحي، ابدأ بإنشاء خطوط خلوية مستقرة تعبر إما عن لوسيفيريز رينيا أو لوسيفيريز اليراعة أو كليهما. بعد ذلك، تحقق وظيفياً من التنظيم المختبري لبنية المراسل المُعبر عنها بشكل مستقر.

تتمثل الخطوة التالية في تطعيم الخلايا في الوسادة الدهنية الثدية والحصول على قراءات لإنزيمي ran وfirefly luciferase وقياسها كمياً. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الكيمياء النسيجية المناعية، في أنها تسمح برؤية طولية وديناميكية لتنظيم الجينات في الجسم الحي أثناء تطور الورم وانتقاله. ابدأ بتقسيم أربع مزارع من خلايا سرطان الثدي T one memory التي تحتوي على ناقل تعبير يشفر إنزيم vanilla luciferase.

تتم عملية التعداء تحت تركيز مُحسّن من المضاد الحيوي لعدة أيام. بعد ذلك، يتم اختيار حوالي 10 مستعمرات فردية تعبر عن ran vanilla luciferase لمراقبة درجة التعبير. استمر في تكثير المستعمرات التي تعبر عن كميات عالية من ran vanilla luciferase لإجراء التحليلات الوظيفية.

قم باستنساخ فرعي لمنطقة المحفز ذات الصلة في بلازميد مراسل لوسيفيراز PGL four يحتوي على علامة اختيار تختلف عن تلك المستخدمة في اختيار التعبير المستقر للفانيلا، ثم قم بترصيص الخلايا الخبيثة واختيار مجموعة متعددة النسائل مستقرة من لوسيفيراز اليراع باستخدام مقايسات جين مراسل لوسيفيراز التقليدية القائمة على الخلايا في المختبر في أطباق ذات 96 بئرًا، وتحقق من أن خلايا DBR تنظم تعبير لوسيفيراز اليراع بطريقة تتوافق مع تلك الملحوظة في الخلايا الأبوية التي تم ترصيصها بشكل عابر. باستخدام هذه الناقلات، ضع الخلايا على هزاز مداري لمدة 15 دقيقة لتحليل الخلايا.

تحقق أيضاً من أن التعبير عن vanilla الذي يحفزه CMV لا يتم تنظيمه بواسطة تحفيزات خلوية متنوعة أو ظروف معالجة مختلفة. قم بتكثير خلايا سرطان الثدي النقيلي DBR 41 ذات الفلورية المشتركة المنخفضة في اليوم السابق للموعد المحدد. في مرحلة التلقيح داخل الجسم الحي، قم بتفكيك خلايا 41 المخصصة للتلقيح باستخدام التربسين.

اغسل الخلايا جيداً في أوساط النمو وقم بتخفيفها في PBS على الفور. تُحفظ على الثلج. يتم تخدير إناث فئران bowel C التي تتراوح أعمارها بين أربعة إلى ستة أسابيع باستخدام isof fluorine.

باستخدام الملقط، أمسك برفق وارفَع وسادة الذاكرة الإربية الرابعة. ضع بعناية إبرة قياس 27.5 بحيث يكون جانب الشطب للأعلى، ثم احقن في وسادة دهون الذاكرة مباشرة تحت الحلمة.

مع توخي الحذر الشديد لتجنب دفع الإبرة داخل التجويف البطني. قم بتحرير الغدة وحقن 50 µL من معلق الخلايا ببطء في الوسادة الدهنية للمامورية بينما لا تزال الفئران تحت تأثير التخدير. ثم احقن 100 µL من red eject cine في الوريد الذيل الجانبي.

ضع الفأر فوراً في نظام التصوير IVUS 200 والتقط صورة لومينسينت لمدة دقيقة واحدة. انقل الفأر مرة أخرى إلى قفصه لمدة ساعة تقريباً، وذلك لضمان تلاشي أي إشارة متبقية من ran vanilla Lucifer. الآن قم بإعطاء D Lucifer potassium salt عبر حقن IP، وبعد خمس دقائق، خدر الفأر باستخدام isof fluorine.

يتم النقل إلى IVUS 200 في موضع مماثل لما كان عليه في عملية الحصول على صورة RAN vanilla الأصلية. باستخدام برنامج IVUS living image المضبط على وضع الفوتونات (photons mode)، يتم تحديد القيم لكل من عمليات الحصول على الصور في firefly و IVUS.

تشكل خلايا 41 شديدة العدوانية أوراماً ملموسة في غضون أسبوع. لذا، قم بحقن الفئران أسبوعياً بمادة red eject cine لمراقبة النمو العام للورم والانبثاث. بعد ذلك، قم بحقن d Lucifer لمراقبة إشارات مسار محدد خلال المراحل المختلفة لتطور الورم.

تتبع نمو الورم الأولي عن طريق تسوية عمليات استحواذ لوسيفيراز RAN بالنسبة للقياسات الأولى عند تلقيح خلايا الورم. والأهم من ذلك، احسب قيم RLR بمرور الوقت لتحديد التنظيم الزمني لأنظمة إشارات فردية بالنسبة لنمو الورم وتطوره. الآن، قارن قيم RLR الرئوية مقابل تلك المحسوبة للورم الأولي لتحديد التنظيم المكاني لأنظمة إشارات فردية بالنسبة لنمو الورم وانتقاله.

تُستخدم الصور المزدوجة للمؤشرات الحيوية المضيئة لتصور وتتبع التغيرات في التركيب الخلوي داخل الورم الأولي. أولاً، يتم خلط خلايا 4T1 التي تعبر عن لوسيفيراز الفانيليا مع نظيراتها من خلايا 4T07 غير النقيلية والمتماثلة جينياً والتي تعبر عن لوسيفيراز اليراعة، ثم تُحقن نسب متفاوتة من مجموعات خلايا سرطان الثدي المختلطة هذه في الوسادة الدهنية الثديية كما هو موضح سابقاً. يتم الحصول فوراً على صور لوسيفيراز اليراعة ولوسيفيراز الفانيليا معاً لتحديد نسبة الإشارة (RS) الأولية الممثلة لمزيج خلوي معين تم تلقيحه.

استمر في الحصول على صور حيوية مضيئة ثنائية طولية لتصوير التركيب الخلوي داخل الورم الأولي. قم أيضاً بتقييم الانتقال المكاني والزماني لكل مشتق من مشتقات سرطان الثدي بالنسبة لنمو الورم وتطوره. وبما أن كل صورة متسقة داخلياً ومضبوطة، فإن الإشارة المستمرة من الورم الأولي تعد مقياساً مهماً لتقييم الفشل الكلي للمتتابعات في كل عملية استحواذ بيانات من نوع vanilla وfirefly.

تعتبر ركيزة اللوسين حساسة للغاية للأكسدة، مما يؤدي إلى حدوث تألق ذاتي. هنا، يؤدي فشل الحقن الوريدي للوسين إلى ظهور إشارة غير محددة من القناة المعوية، وليس من الورم الأولي المترسخ. وفي هذه العملية الناجحة لاستئصال كلية من فأر يحمل ورماً أولياً وناكضات رئوية، يمكن اشتقاق قياسات إشارات محددة للمسار من خلال تصوير لوسيفيراز اليراعة.

تتيح هذه البيانات حساب RS لكل من الورم الأولي والنقائل الرئوية. وبعد الانتهاء من هذه التجربة، يمكن استخدام تقنيات أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية والتهجين الموضعي للتحقق من أن النتائج في mRNA والبروتين يتم تنظيمها بطريقة مماثلة للبنية التي أبلغت عنها.