والطريقة انماط PCR القائم على التمييز بين الأنواع البرية من نوع والزينة لل Imperata cylindrica

الهدف الرئيسي من هذا الإجراء هو توفير بروتوكول التنميط الجيني الجزيئي السريع والفعال من حيث التكلفة والذي يمكنه التفريق بين أنواع Retta cylindrica ، والتي تسمى عادة عشب gon ، والتي لا يمكن تمييزها عن طريق التشكل وحده. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحديد وعزل الأنسجة أولا من مجموعة متنوعة من عشب الغون ذات الأهمية. الخطوة التالية هي استخراج الحمض النووي والجص من الأنسجة التي تم جمعها.

بعد ذلك ، يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على الحمض النووي المستخرج باستخدام مواد أولية محددة تستهدف اختلافات التسلسل في PLAs تتحول إلى منطقة LF ، بالإضافة إلى الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة. الخطوة الأخيرة هي إجراء الرحلان الكهربائي للهلام على كل تفاعل من تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الأربعة لتصور منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المضخمة. في النهاية ، يتم تحديد مجموعة متنوعة من عشب الغون الذي تم جمعه من خلال تحليل التنوع الناتج ، وحظر منتجات PCR المحدد على هلام الخطط الغازية تكلف الولايات المتحدة حوالي 3.4 مليار سنويا ، مما يتسبب في أضرار جسيمة لكل من الموارد الزراعية والطبيعية.

البري imparato Electrica ، المعروف أيضا باسم Cogan ، العشب هو واحد من أسوأ 10 أعشاب غازية في العالم. يشكل عشب الكوجان انتشارا سريعا في أكشاك أحادية تحل محل النباتات المحلية ، وبالتالي ، فإن التي تعتمد على هذا الغطاء النباتي الأصلي عشب GaN تصيب حاليا 490 مليون هكتار في جميع أنحاء العالم وحوالي 500،000 هكتار في الولايات المتحدة ويتم تسويق مجموعة متنوعة من الزينة من ti of tus centrica على نطاق واسع تحت أسماء tus Centrica ، أربرا ، بارين أحمر ، والدم الياباني فظ كما نسميه JBG. يفترض أن هذا التنوع معقم وغير جراحي ، ويعتبر مرغوبا فيه لأوراقه الحمراء اللون.

في ظل ظروف معينة ، يمكن أن ينتج عشب الدم الياباني بذورا قابلة للحياة ويعود إلى شكل أخضر بالكامل لا يمكن تمييزه عن عشب الكوجان من النوع البري. كما ترون ، كلاهما يمتلك أوراقا خضراء وأكبر من مجموعة الزينة التقليدية ذات الأوراق الأكبر. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي النباتات المعكوسة والبرية على جذور أكبر ومجموعة الزينة تزيد من إمكاناتها الإنجابية اللاجنسية.

الارتداد يجعل التحديد من خلال التشكل وحده. مهمة صعبة. توفر الطرق الجزيئية وسيلة للتمييز بدقة بين النباتات الغازية والمواد النباتية التي لا يمكن التعرف عليها من خلال الوسائل البصرية العادية.

تعتبر الطرق الجزيئية ضرورية للحماية من انتشار وإدخال النباتات الغازية. يوفر تطبيق هذا البروتوكول الجزيئي وسيلة للتمييز بدقة بين عشب الدم الياباني والعشب كوغان. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في منع الحدوث المشترك مع عشب كوجان والتكوين المحتمل للأنواع الهجينة القابلة للحياة.

الميزة الأساسية لهذه التقنية على التقنيات الحالية مثل تعدد الأشكال بطول الشظايا المضخم ، أو تحليل FLP وأشياء مثل تسلسل الحمض النووي ، هي أنها توفر تقنية التنميط الجيني الجزيئي الفعالة من حيث التكلفة وسريعة للغاية والتي يمكنها بسهولة التمييز بين عشب كوجان من النوع البري وأنواع عشب الدم الياباني. سيظهر هذه التقنية جوزيف هيري ، طالب جامعي من مختبرنا. حدد أولا عينة من موقع ينمو فيه عشب الغون أو عشب الدم الياباني ويحتاج إلى تمييزه عن بعضهما البعض.

يمكن تمييز عشب الدم الياباني بسهولة عن عشب الغون البري بأوراقه الحمراء الزاهية. ومع ذلك ، لا يمكن تمييز عشب الدم الياباني تقريبا عن عشب كوجان لأن كلاهما يحتوي على أوراق خضراء أطول ومساحة أوراق أكبر وجذور أكبر من عشب الدم الياباني للزينة. يمكن استخدام هذه الطريقة على مناديل الأوراق الطازجة والمجمدة والمجففة مؤخرا.

في حالة تخزين الأنسجة لاستخراج الحمض النووي في وقت لاحق ، فإن أفضل طريقة هي تجميد الأنسجة وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر على الفور. إذا كان التخزين الجاف ضروريا ، ضع المنديل في مظروف ورقي وقم بتخزين الظرف في هلام السيليكا المجفف أو المجففات النشطة الأخرى في درجة حرارة الغرفة. إذا كان سيتم استخدام الأنسجة الطازجة ، فتأكد من استخراج الحمض النووي في غضون ثلاث ساعات من التجميع لمنع التدهور.

يستخدم هذا الإجراء مجموعة مصغرة لنباتات DNEZ من Kyogen وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع تعديل طفيف واحد. هنا. تم تكييف الإجراء بحيث يتم استخدام أكثر من 100 ملليغرام من الأنسجة الطازجة أو المجمدة أو أكثر من 20 ملليغرام من الأنسجة المجففة. قم أولا بطحن أكثر من 100 ملليغرام من أنسجة الأوراق الطازجة أو المجمدة ، أو أكثر من 20 ملليغرام من أنسجة الأوراق الجافة إلى مسحوق ناعم باستخدام ثلاث جولات من النيتروجين السائل مع الطحن في ملاط ومدقة مبردة.

قم بوزن المسحوق المجمد من الأنسجة الطازجة أو المجمدة إلى 100 ملليغرام. في حالة استخدام أنسجة الأوراق الجافة ، قم بوزن المسحوق إلى 20 ملليغرام. بعد هذه الخطوة ، تابع استخراج الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام مقياس الطيف الضوئي مثل اختبار مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ، والحمض النووي ، والجودة والكمية ، ويجب أن تكون إنتاجية الحمض النووي الجيدة بين 50 و 150 نانوغرام لكل ميكرولتر مع اثنين من 60 على نسبتين 80 و 2 32 80 قريبة من 2.0 كما رأينا. هنا.

إجراء الرحلان الكهربائي باستخدام هلام AROS القياسي 1٪. تحقق من وجود نطاقات كبيرة نسبيا أكبر من 10 كيلوبايت مع عدم وجود خطوط أو خطوط قليلة من تلوث الحمض النووي الريبي إذا كان تركيز الحمض النووي مرتفعا، وقم بتخفيف العينات إلى 70 نانوغراما لكل ميكرولتر للخطوات اللاحقة. تعتمد بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدمة في هذا البروتوكول المشار إليها بالسهمين الأحمر والأخضر على اختلافات التسلسل بين منطقة فاصل LF الملصقة لعشب كوجان والأنماط الجينية لعشب الدم الياباني.

تأتي هذه الاختلافات في شكل تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة والإدخالات والحذف المشار إليها بواسطة الأسهم السوداء العمودية ، والتي تسمح بتطوير بادئات محددة متنوعة. من خلال تحديد موقع البادئات في مواقع التسلسلات الفريدة ، يتم تضمين التسلسلات التمهيدية في الجزء المكتوب من البروتوكول لكل عينة من الحمض النووي المعزولة التي تقوم بإعداد تفاعلين PCR سعة 50 ميكرولتر في أنابيب PCR رقيقة الجدران سعة 0.2 ملليلتر على ICE باستخدام كل مجموعة أولية وفقا للبروتوكول المكتوب. إذا كان تركيز الحمض النووي منخفضا ، فيمكن إضافة المزيد من الحمض النووي إلى كل تفاعل مع ضبط كمية الماء المقطر المزدوج الخالي من النوكلياز بحيث يظل حجم التفاعل الكلي 50 ميكرولترا.

لا تستخدم أكثر من خمسة ميكرولترات من الحمض النووي أو 10٪ من الحجم الكلي لكل تفاعل لأن الشوائب الموجودة في عينات الحمض النووي قد تمنع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل للتأكد من أن جميع كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل تعمل ، وإعداد التحكم الإيجابي بشكل جيد. باستخدام بادئات التحكم الإيجابية ، قم بإعداد التحكم السلبي باستخدام نفس مجموعة التمهيدي للتحكم مثل عنصر التحكم الإيجابي ، ولكن مع الماء المقطر المزدوج بدلا من الحمض النووي المستخرج في هذه المرحلة ، هناك ما مجموعه أربعة تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل عينة يتم اختبارها. بعد ذلك ، قم بإجراء تضخيم PCR في جهاز تدوير حراري مزود بغطاء ساخن باستخدام معلمات دورة PCR في تحسين البروتوكول المكتوب لدرجة حرارة الركوع الأولية ، وقد تكون هناك حاجة إلى أوقات التمديد وعدد الدورات اعتمادا على جودة بادئات الحمض النووي أو البوليميراز أو نوع التدوير الحراري المستخدم.

بمجرد اكتمال تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، افصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام 1٪ باستخدام الرحلان الكهربائي القياسي. قم بتشغيل العينات عند حوالي 120 فولت حتى تصل الجبهة D إلى ثلاثة أرباع الطول الإجمالي للهلام. تصور الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية وافحص العصابات الناتجة لمعرفة ما إذا كان قد تم تضخيم جزء الحمض النووي المناسب.

يوضح هذا الجل التمثيلي نتائج الرحلان الكهربائي لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المشتقة من عشب كوجان ، وعشب الدم الياباني ، وعشب الدم الياباني ، وعينات الحمض النووي العائدة جنبا إلى جنب مع عشب كوجان والبادئات الخاصة ب JBG ، بالإضافة إلى التحكم الإيجابي LF والتحكم السلبي بدون قالب. تعمل مجموعة التمهيدي للتحكم الإيجابي LF بشكل جيد مع عشب Cogan وعشب الدم الياباني وعودة عشب الدم الياباني والأعشاب الأخرى ، وسينتج عنه نطاق مكون من 890 زوجا أساسيا. إذا كانت جميع كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل خالية من ملوثات الحمض النووي ، فلن يؤدي تفاعل التحكم السلبي إلى منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

إذا كانت عينة الحمض النووي مشتقة من عشب كوجان من النوع البري ، فإن تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة التمهيدي الخاصة بعشب كوجان سينتج عنه نطاق واحد يبلغ حوالي 595 زوجا أساسيا ، في حين أن البادئات المحددة ل JBG لن تؤدي إلى أي نطاق. وبالمثل ، إذا كانت عينة الحمض النووي مشتقة من JBG أو تفاعل J-B-G-A-P-C-R ، فإن استخدام مجموعة التمهيدي الخاصة ب JBG سيؤدي إلى نطاق واحد عند حوالي 594 زوجا أساسيا. في حين أن الاشعال الخاصة بعشب كوجان لن تؤدي إلى أي فرقة.

نظرا لأن JBG و JBG المعكسوة لهما تسلسل حمضي نووي متطابق ، فسيكون لهما بالتالي أنماط نطاقات متطابقة. ومع ذلك ، فإن الاختلافات المورفولوجية بين ارتدادات JBG و JBG واضحة إلى حد ما ، لذلك في حين أن نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل ستكون هي نفسها ، فمن السهل التمييز بين أصناف JBG على مستوى النبات. يمكن أن يحدد تسلسل الحمض النووي لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التغييرات المحتملة في تسلسل الحمض النووي للنمط البيئي المختلف لعشب الكوجان.

يوفر تطوير هذه التقنية أول طريقة جزيئية مبسطة يمكنها التمييز بدقة بين النوع البري K والعشب والشكل المعكسس لصنف الزينة عشب الدم الياباني. نشجع مستخدمي هذا البروتوكول على الاتصال بنا للإبلاغ عن النتائج المستمدة من استخدام هذا البروتوكول. ستساعد هذه المعلومات المشتركة في توفير معلومات حول توزيع عشب الدم الياباني.

سيساعد هذا أيضا المنظمين في وزارة الزراعة الأمريكية على اتخاذ قرارات مستنيرة بشأن الإجراءات التي قد تكون ضرورية للتحايل على الانتشار والتهجين المحتمل لأصناف عشب كوجان شديدة التوغل.