وساطة رني ضربة قاضية بواسطة الجينات وTransgenesis Microinjection في نيماتودا Necromenic Pristionchus pacificus

الهدف العام من هذا الإجراء هو إتمام عملية تحويل الحمض النووي الغريب بنجاح وتعطيل وظيفة الجين في ديدان Priyanka Pacificus. وبالنسبة للتحول الجيني، ابدأ بتحضير الحمض النووي الجينومي المناسب ذو النهايات المتماسكة المتوافقة.

بالنسبة لتداخل الحمض الريبي (RNA interference)، قم بتخليق الجين المستهدف باستخدام طقم نسخ الحمض الريبي ثنائي السلسلة (double stranded RNA transcription kit). ثم قم بحقن الـ PRIs DIANCA pacificus مجهرياً باستخدام DNA أو الحمض الريبي ثنائي السلسلة. قم بفحص مجتمع F1 للبحث عن النمط الظاهري للمؤشر المختار في عملية التحول الجيني (transgenesis)، واختيار النمط الظاهري للتثبيط (knockdown phenotype) في حالة تداخل الحمض الريبي للتحول الجيني.

استمر في مراقبة نتائج الديدان المعدلة وراثياً من الجيل الثاني للحصول على نتائج تظهر تعبيرات جينية محددة باستخدام مراسل GFP عبر المجهر الفلوري. مرحباً، أنا راي هونغ من جامعة ولاية كاليفورنيا في نورثريدج، وسيوضح هذا العرض الخطوات المتبعة للتلاعب الجيني في ديدان خيطية محددة. وفي الكائنات الحية النموذجية الناشئة، يمكن لإجراء تداخل RNA (RNAi) والتخليق الجيني الإجابة على أسئلة رئيسية في علم الأحياء التنموي والسلوك من خلال توصيف وظائف الجينات وتعبيراتها.

سيستفيد الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة من مشاهدة كيفية وضع الدودة على وسادة الحقن وكيفية حقن الدودة في المستوى البؤري الصحيح حيث تكون الغدد التناسلية (gonads) مرئية. وبخلاف غيرها، فإن الغدد التناسلية في *C. elegans* محددة لأنها تتقاطع مع بعضها ظهرياً وتهاجر تدريجياً مع تطور النيماتودا من المرحلة اليرقية الرابعة (J4) المتأخرة إلى مرحلة البلوغ. بالإضافة إلى ذلك، يجب إضافة الحمض النووي الجينومي (genomic DNA) المهضوم باستخدام إنزيمات قطع متوافقة إلى الجينات المنقولة وعلامة الحقن المشترك لتحضير خليط الحقن.

سيقوم مختبر جيسيكا سينجل في مختبري بتوضيح عملية الحقن المجهري في حالة PRIs المحددة. من أجل التعديل الوراثي، تتطلب العملية حقن بنيات 3D NA، بالإضافة إلى علامة الحقن المشترك السائدة. يتم هضم بنيات الحمض النووي المستهدفة والجين المراسل وبنيات genomic D-N-A-D-N-A باستخدام إنزيمات قطع متوافقة. يتم تجميع بنيات DNA باستخدام بروتوكول الترسيب بالإيثانول.

يتم تحضير خليط الحقن بالتركيزات المذكورة في الجدول. تحقق من إعدادات مقياس الضغط بخزان النيتروجين. الآن، قم بتحميل 1 إلى 2 µL من خليط الحقن في الإبرة.

ضع الإبرة في جهاز التحكم في الحقن المجهري. اكسر طرف الإبرة عن طريق ملامسته برفق لحافة أنبوب شعري مسحوب بدقة موضوع على شريحة زجاجية، ثم ثبته في وضع السكون. الآن صب زيت البارافين لتغطية شريحة تحتوي على أربعة من الديدان البالغة الصغيرة.

اختر دودة واحدة وانقلها إلى وسادة الحقن. تحت المجهر، قم بوضع مبيض الدودة في اتجاه الإبرة مع جعل الفرج بعيداً عن الإبرة. الآن، قم بخفض الإبرة إلى الموضع الظاهر في عرض المجهر.

اجعل الجزء العلوي من الغدة التناسلية والإبرة في نفس المستوى البؤري. ادفع الإبرة بلطف داخل الدودة واحقن خليط الحقن. لاحظ انفصال البويضات نحو الطرف القاصي، وهو ما يشير إلى نجاح عملية الحقن.

أعد وضع الإبرة لحقن الغدة التناسلية السفلية وكرر عملية الحقن. وبما أن هذه الغدة تقع تحت الأمعاء، فلن يكون انتشار البيض مرئياً، وبالتالي سيكون من الأصعب تقدير مدى نجاح الحقن. ومع ذلك، يجب أن تظل الدودة بعد الحقن سليمة دون بروز الغدد التناسلية.

أعد الإبرة إلى وضع السكون. أضف قطرة من محلول M9 المنظم لإنقاذ الدودة باستخدام بعض بكتيريا OP 50 على ملقط. المس الدودة ببكتيريا OP 50 بحيث تلتصق بها.

انقل الدودة الآن إلى طبق يحتوي على بقع بحجم 50 µL من OP 50. تُحفظ الديدان المحقونة عند درجة حرارة 20 °C لمدة أربعة أيام تقريبًا لوضع البيض ونمو الجيل F1. ثم يتم فحص الديدان للكشف عن النمط الظاهري المحدد.

انقل أفراد الجيل F1 المنفردة التي تظهر عليها النمط الظاهري الملحوظ إلى طبق استزراع جديد واحفظها في درجة حرارة 25 degrees Celsius. وأخيراً، بالنسبة للسلالات المعدلة وراثياً، انقل أفراد الجيل F2 المنفردة إلى أطباق فردية. واحفظ الأجيال اللاحقة في درجة حرارة 20 degrees Celsius.

تعد عملية التحكم في وظيفة الجينات على مستوى الكائن الحي عن طريق تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) والنقل الجيني من الجوانب الرئيسية لنموذج Ppac pacificus في علم الأحياء التطوري والتنموي؛ فمقارنة بدودة من النوع البري على اليسار، ينتج عن السلالة المعدلة وراثياً والمستقرة F four PPR L three نمط "المدحرج" السائد الذي يظهر تعبيراً لبروتين GFP في عصبونات الرأس. وعلى العكس من ذلك، تؤدي تجربة RNA I هذه إلى إنتاج طفرات PRL one التي تظهر تثبيطاً كاملاً لحركة التدحرج التي تلاحظ عادةً في طفرة اكتساب الوظيفة PRL one roller TU 92. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام كل عملية حقن في غضون خمس دقائق. ومن المهم تذكر أن جميع أفراد الجيل F twos من سلالات F1 المعدلة وراثياً والمدحرجة والمستقلة يجب اختيارها بشكل فردي لتأسيس سلالات F two promi مستقلة.

وذلك لأننا وجدنا أن تعبير GFP يتفاوت بشكل كبير بين خطوط F two، كما أن انتقال النمط الظاهري للدرفلة (roller phenotype) لا يرتبط بمستوى تعبير G.