رسم الخرائط البصرية إمكانيات العمل والعابرون الكالسيوم في القلب ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو رسم الخرائط الضوئية لكل من جهد الغشاء عبر الخلوي والعابر الكالسيومي داخل الخلايا في وقت واحد في قلوب الفئران المعزولة والسليمة التي يتم ترويتها بسائل لانجندريز-هس (LOR). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استئصال قلب الفأر السليم، ثم قسطرة الشريان الأورطي وبدء التروية بسائل LOR. وتتمثل الخطوة التالية في تثبيت القلب عن طريق تحميله على قارن الانقباض والتحفيز، ثم تثبيت القلب بدبابيس في غرفة التروية.

تتمثل الخطوات النهائية في تحميل الأصباغ البصرية واتخاذ الاستعدادات اللازمة لتقليل آثار الحركة خلال التجربة. يتم الحصول على الصور البصرية عن طريق تجميع الضوء المنبعث من القلب باستخدام كاميرات my cam Ultima LC Moss. مرحباً، اسمي دي.

أنا طالب دراسات عليا في جامعة واشنطن. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل القطب الكهربائي الدقيق، في أن الخرائط الضوئية تتيح دقة مكانية أكبر عبر كامل سطح القلب. مرحبًا، أنا مات سولكين.

أنا طالب دراسات عليا في جامعة واشنطن. هذه الطريقة، إذا نُفذت بشكل صحيح، يمكن أن تساعد في الإجابة على العديد من الأسئلة في الفيزيولوجيا الكهربائية للقلب، مثل أساس نشوء اضطرابات نظم القلب. ابدأ بضبط مضخة تمعجية واحدة لتدوير المحاليل بمعدل 40 milliliters per minute.

بعد ذلك، اضبط مضخة تمعجية ثانية على 80 milliliters per minute. تقوم هذه المضخة بإعادة Perfuse eight إلى خزان الاحتفاظ والأكسجة. قم بتشغيل المضخات واغسل النظام باستخدام لتر واحد من 70%ethanol لمدة 30 minutes مع إعادة التدوير.

اتبع عملية الغسل هذه بلترين من الماء منزوع الأيونات دون إعادة تدوير. وبمجرد تفريغ الماء، قم بتدوير لترين من محلول Tyro وتمريره عبر مرشح بدقة 5 ميكرون. قم بتدفئة جهاز التروية حتى 37 °C باستخدام غلاف مائي وجهاز تدوير، وقم بضخ غاز مؤكسج في المحلول.

اضبط معدل فقاعة الغاز للحفاظ على قيمة pH عند 7.35 زائد أو ناقص 0.05. راقب كلاً من pH ودرجة الحرارة أثناء التجربة. يتكون جهاز المسح الضوئي المزدوج من كاميرتين CMOS عاليتا السرعة يمكنهما التقاط صورة بدقة 100 في 100 بكسل بمعدل 3000 إطار في الثانية.

قم بتثبيت مرشح تمرير نطاقي (band pass filter) على كاميرا تصوير الكالسيوم، وثبت مرشح تمرير طويل (long pass filter) على كاميرا تصوير الجهد الكهربائي باستخدام حامل كاميرا مزدوج. قم بتثبيت مرآة ثنائية اللون (dichroic mirror) وعدسة بحيث تقوم العدسة بتركيز ضوء الانبعاث القادم من القلب على المرآة. كما يجب تثبيت الكاميرتين على الحامل وترتيبهما بحيث تكونان متعامدتين فيما بينهما.

بعد ذلك، قم بإعداد ضوء الاستثارة. يتم توليد الضوء بواسطة مصباح هالوجين وتوجيهه عبر دليل ضوئي مرن. مرر الضوء عبر مرشح حراري، وغالق للحد من التعرض، ومرشح تمرير نطاق الاستثارة.

أخيرًا، قم بتجهيز أقطاب الفضة وكلوريد الفضة عن طريق تركيبها في الغرفة. وبعد مراجعة وضبط المستويات في المضخمات والمرشحات بدقة، يصبح الجهاز جاهزًا لاستقبال القلب. استخدم مزيجًا من الكيتامين والزيلازين مع 100 units من الهيبارين لتخدير الفأر قبل البدء.

تأكد من عدم وجود رد فعل للألم لدى الحيوان عن طريق قرص إصبع القدم. بعد إجراء شق في منتصف القص، قم بإزالة القلب والأنسجة المحيطة به بسرعة. ثم باستخدام مجهر التشريح وبسرعة، حدد الشريان الأورطي وقم بإجراء قطع نظيف عبر الشريان الأورطي الصاعد أسفل الشريان تحت الترقوة الأيمن.

قم الآن بتثبيت جزء قصير من الشريان الأبهر بكانولا مخصصة مقاس 21 باستخدام أربعة خيوط جراحية من الحرير المجدول الأسود مقاس 0. بعد عملية القنطرة، قم بإجراء تروية عكوسة وتروية فائقة للقلب باستخدام محلول Tyro، مع ضبط معدل التدفق للحفاظ على ضغط الشريان الأبهر بين 60 و 80 millimeters Mercury كما يتم قياسه بواسطة محول الضغط.

قم الآن بتشريح وإزالة الرئة والغدة الزعترية والأنسجة الدهنية المحيطة. ثم أدخل أنبوب سيليكون في البطين الأيسر عبر الأوردة الرئوية. قم بخياطة الأنبوب بالأنسجة الضامة المجاورة.

تمنع هذه الخطوة البالغة الأهمية حدوث الاحتقان والتحمض في محلول Perfuse eight المحتبس في البطين الأيسر، خاصة بعد تثبيط انقباضات البطين. ولمنع حركات القلب الناتجة عن محلول Perfuse eight، قم بتثبيت القلب بدبوس في قاع غرفة التروية المغلفة بـ sill guard من جهة القمة. علاوة على ذلك، قم بشد وتثبيت الزائدتين الأذينيتين اليمنى واليسرى لزيادة مساحة سطح الأذينين في الوضع العمودي.

سيعمل ذلك على زيادة مساحة سطح التسجيل إلى الحد الأقصى. ولإجراء تحفيزات التنسيق، قم بتثبيت قطب كهربائي مُصنّع خصيصاً على سطح القلب. ولتقليل آثار الحركة الاصطناعية، قم بتثبيت غطاء زجاجي صغير فوق القلب على سطح المحلول.

قم بذلك عن طريق تثبيت الزجاج بين عدة دبابيس. كتحضيرات نهائية، ركز ضوء الإثارة على القلب وقم بضبط وضعيات الكاميرات للحصول على صورة بصرية، ثم ابدأ في تحميل الصبغة أثناء عملية التحميل. راقب تسجيلات ECG باستمرار لضمان الوظيفة الكهربائية الطبيعية للقلب.

ابدأ بتدفئة BLEs statin حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اخلط نصف مليلتر من BLEs statin في profuse eight داخل خزان الاحتفاظ، وخفف الـ 1/10 مليلتر المتبقية من BLEs statin في مليلتر واحد من محلول Tyros. وعلى مدار الـ 20 دقيقة التالية، احقن BLEs statin في Tyros ببطء عبر منفذ الدواء القريب من الكانيولا.

ستعمل مادة الستاتين (statin) في BLEs على تقليل تشويش الحركة تدريجياً. بعد ذلك، قم بتخفيف 30 µL من صبغة حساسة للجهد في 1 mL من محلول تيرو (tyro solution)، ثم احقن هذا الخليط ببطء على مدار خمس إلى سبع دقائق في نفس منفذ الدواء. بعد ذلك، قم بتحضير الخليط ذاته مرة أخرى.

في هذه المرة، يتم إضافة 30 µL إضافية من مؤشر الكالسيوم. يُوضع هذا المزيج ببطء على مدار 5 إلى 10 دقائق عبر نفس المنفذ. بعد حقن مؤشر الكالسيوم، انتظر من 5 إلى 10 دقائق إضافية حتى يقوم الـ BLE statin بتثبيط الحركة تماماً، ولتتمكن الأصباغ من دخول الخلايا قبل البدء في التجربة.

تم تحضير هذا القلب. ووفقاً للبروتوكول، تم تسجيل إشارات ECG أثناء تحفيز البطين بنمط S one S one. كما تم تسجيل جهود الفعل وإشارات عابر الكالسيوم من الأذينين على اليسار والبطينين على اليمين.

يوضح السهم موقع حدوث تشتت الإشارة من البطينين؛ ومن خلال تجميع تسجيلات الكاميرا في وحدات تبلغ ثلاثة بكسلات في ثلاثة بكسلات، يمكن عرض مصفوفة من عوابر الكالسيوم وجهود الفعل من بيانات المصفوفة. كما يمكن إنشاء شكل يوضح توصيل جهد الفعل. وتظهر البيانات المأخوذة من ثلاث نقاط متتالية على المحورين المستعرض والطولي تغير السعة مع انتشار جهد الفعل عبر سطح البطين.

وبالمثل، يمكن إنشاء شكل يوضح مدد جهد الفعل وعابر الكالسيوم. يظهر هذا الشكل حالة ضابطة على اليسار وأخرى على اليمين. حيث تم حقن القلب بمادة isoproterenol، مما أدى بوضوح إلى تقصير مدة كل من عابر الكالسيوم وجهود الفعل.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات باتباع هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل بروتوكول التحفيز (pacing protocol)، للإجابة على تساؤلات إضافية، مثل تلك المتعلقة بفترة الجموح للعقدة الأذينية البطينية (AV node).