رسم الخرائط البصرية إمكانيات العمل والعابرون الكالسيوم في القلب ماوس
September 13th, 2011
perfused تفاصيل هذه الورقة إجراء تشريح ، والإعداد مفيدة ، والظروف التجريبية خلال رسم الخرائط البصرية المحتملة عبر الغشاء (VM) والكالسيوم داخل الخلايا عابرة (CAT) في قلوب سليمة Langendorff معزولة الماوس.
الهدف العام من هذا الإجراء هو رسم خريطة بصرية في وقت واحد لإمكانات الغشاء والعابر داخل الخلايا الكالسيوم في قلوب الفئران المعزولة LOR السليمة. يتم تحقيق ذلك عن طريق استئصال قلب الفأر السليم أولا ، ثم قنية الشريان الأورطي وبدء تروية LOR. الخطوة التالية هي شل حركة القلب عن طريق تحميل تقلص الإثارة على المقرنة ثم تثبيت القلب في غرفة التروية.
تتمثل الخطوات النهائية في تحميل الأصباغ البصرية وإجراء الاستعدادات لتقليل القطع الأثرية للحركة أثناء التجربة. يتم الحصول على الصور البصرية عن طريق جمع الضوء المنبعث من القلب باستخدام كاميرات الكاميرا Ultima LC Moss. مرحبا ، اسمي دي.
أنا طالب دراسات عليا في جامعة واشنطن. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية ، مثل القطب الصغير ، هي أن رسم الخرائط البصرية يسمح بدقة مكانية أكبر على كامل سطح القلب. مرحبا ، أنا مات سولكين.
أنا طالب دراسات عليا في جامعة واشنطن. يمكن أن تساعد هذه الطريقة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، في الإجابة على العديد من الأسئلة في الفيزيولوجيا الكهربية للقلب مثل أساس عدم انتظام ضربات القلب. ابدأ بتكوين مضخة تمعجية واحدة لتدوير المحاليل بسرعة 40 مل في الدقيقة.
ثم اضبط المضخة التمعجية الثانية على 80 مل في الدقيقة. تعيد هذه المضخة Perfuse ثمانية إلى خزان التثبيت والأكسجين. قم بتشغيل المضخات واغسل النظام بلتر واحد ، 70٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة مع إعادة التدوير.
اتبع هذا الغسيل ب لترين من الماء منزوع الأيونات دون إعادة تدوير. بمجرد إخلاء الماء ، قم بتدوير لترين من محلول Tyro وقم بتمريره عبر مرشح خمسة ميكرون. قم بتسخين النفهات من ثماني إلى 37 درجة مئوية باستخدام سترة مائية وفقاعة دائرية للغاز المؤكسج في المحلول.
اضبط معدل فقاعات الغاز للحفاظ على الرقم الهيدروجيني عند 7.35 زائد أو ناقص 0.05. راقب كل من الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة أثناء التجربة. يتكون جهاز رسم الخرائط البصرية المزدوج من كاميرتين عالية السرعة C moss يمكنهما التقاط صورة 100 × 100 بكسل بمعدل 3000 إطار في الثانية.
قم بتوصيل مرشح تمرير النطاق بكاميرا تصوير الكالسيوم وقم بتوصيل مرشح تمرير طويل بكاميرا تصوير الجهد الكهربائي على حامل كاميرا مزدوج. قم بتوصيل مرآة ثنائية وعدسة بحيث يتم تركيز الضوء المنبع القادم من القلب على المرآة بواسطة العدسة. أيضا ، قم بتوصيل كاميرتين بالحامل ورتبهما بحيث يكونا متعامدين مع بعضهما البعض.
بعد ذلك ، قم بإعداد ضوء الإثارة. يتم إنشاء الضوء بواسطة مصباح هالوجين ويتم توجيهه من خلال دليل إضاءة مرن. مرر الضوء عبر مرشح حراري ومصراع للحد من التعريض الضوئي ومرشح تمرير نطاق الإثارة.
أخيرا ، قم بإعداد أقطاب كلوريد الفضة والفضة عن طريق تثبيتها في الغرفة. بعد التحقق المزدوج وضبط المستويات على مكبرات الصوت والمرشحات ، يكون الإعداد جاهزا للقلب. استخدم مزيجا من الكيتامين والزيلازين مع 100 وحدة من الهيبارين لتخدير الفأر قبل المتابعة.
تأكد من أن ليس لديه رد فعل للألم باستخدام قرصة إصبع القدم. بعد إجراء شق في منتصف القص ، قم بإزالة القلب والأنسجة المحيطة به بسرعة. ثم باستخدام مجهر التشريح بسرعة ، حدد الشريان الأورطي وقم بعمل قطع نظيف عبر الشريان الأورطي الصاعد أسفل الشريان تحت الترقوة الأيمن.
الآن قم بإرفاق قسم قصير من الشريان الأورطي بقنية قياس 21 مصنوعة خصيصا باستخدام أربع خيوط حريرية مضفرة سوداء بعد التقنية الرجعية إلى حد كبير بيرفو ودمج القلب الفائق. مع محلول Tyro ، اضبط معدل التدفق للحفاظ على ضغط الأبهر بين 60 و 80 ملم. الزئبق كما تم قياسه بواسطة محول الضغط.
الآن قم بتشريح وإزالة الغدة الصعترية المحيطة والأنسجة الدهنية. الآن أدخل أنبوب سيليكون في البطين الأيسر من خلال الأوردة الرئوية. خياطة الأنبوب على النسيج الضام القريب.
هذه الخطوة المهمة للغاية تمنع احتقان وتحمض بيرفيوز ثمانية المحاصرين في البطين الأيسر ، خاصة بعد قمع تقلصات البطين. لمنع حركات القلب المستحثة الثماني من Perfuse ، قم بتثبيت القلب في الجزء السفلي من غرفة التروية المطلية بواقي العتبة في قمتها. علاوة على ذلك ، قم بتمديد الزوائد الأذينية اليمنى واليسرى وتثبيتها لزيادة مساحة سطح الأذينين في التكوين الرأسي.
سيؤدي ذلك إلى زيادة مساحة سطح التسجيل. لإجراء محفزات السرعة ، قم بتوصيل قطب كهربائي مخصص بسطح القلب. لتقليل القطع الأثرية للحركة، ضع غطاء زجاجا صغيرا فوق القلب على سطح المحلول.
افعل ذلك عن طريق ربط الزجاج بين عدة دبابيس. كاستعدادات نهائية ، ركز ضوء الإثارة على القلب ووضع الكاميرات للحصول على صورة بصرية ثم ابدأ بتحميل الصبغة أثناء تحميل القوالب. راقب باستمرار تسجيلات تخطيط القلب لضمان الوظيفة الكهربائية الطبيعية للقلب.
ابدأ بتسخين الستاتين BLEs إلى درجة حرارة الغرفة. ثم امزج نصف مليلتر من الستاتين BLEs في الثمانية الغزيرة في خزان الاحتجاز ، وقم بتخفيف 10 مليلتر المتبقي من الستاتين BLEs إلى مليلتر واحد من محلول Tyros. خلال ال 20 دقيقة القادمة ، قم بحقن الستاتين BLEs ببطء في التيروس من خلال منفذ المخدرات بالقرب من القنية.
سيقلل الستاتين BLEs تدريجيا من قطعة الصنع الحركية. بعد ذلك ، قم بتخفيف 30 ميكرولترا من الصبغة الحساسة للجهد في محلول تيرو مليلتر واحد ، وحقن هذا الخليط ببطء على مدى خمس إلى سبع دقائق في نفس منفذ الدواء. ثم اصنع نفس الخليط مرة أخرى.
هذه المرة ، إضافة 30 ميكرولترا إضافيا من مؤشر الكالسيوم. ضع هذا الخليط ببطء على مدى خمس إلى 10 دقائق من خلال نفس المنفذ. بعد حقن مؤشر الكالسيوم ، انتظر من خمس إلى 10 دقائق إضافية حتى تمنع الستاتين BLEs الحركة تماما ، ولكي تدخل الأصباغ إلى الخلايا قبل متابعة التجربة.
تم إعداد هذا القلب. وفقا للبروتوكول ، تم تسجيل إشارات تخطيط القلب أثناء الإيقاع البطيني من تحفيز S واحد S واحد. تم تسجيل إمكانات الفعل وإشارات الكالسيوم العابرة من الأذينين على اليسار والبطينين على اليمين.
يوضح السهم مكان تشتت الإشارة من البطينين عن طريق تجميع التسجيلات من الكاميرا بوحدات من ثلاثة بكسل في ثلاثة بكسل ، ويمكن عرض مجموعة من عابرات الكالسيوم وإمكانات الفعل من البيانات من بيانات المصفوفة. يمكن إنشاء شكل يوضح توصيل جهد الفعل. تظهر البيانات من ثلاث نقاط متتالية على المحور المستعرض والطولي تغير السعة مع انتشار جهد الفعل عبر سطح البطين.
وبالمثل ، يمكن إنشاء شكل يوضح إمكانات الفعل وفترات الكالسيوم العابرة. يظهر هذا حالة تحكم على اليسار على اليمين. تم إعطاء حقنة من الأيزوبروتيرينول للقلب ، مما يقلل بوضوح من مدة كل من عابرات الكالسيوم وإمكانات العمل.
بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات بعد هذا الإجراء. يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل بروتوكول السرعة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تلك المتعلقة بفترة مقاومة للعقدة AV.
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة إجراءً مفصلاً للرسم البصري للإمكانات العابرة للغشاء والتحولات الكالسيوم داخل الخلايا في قلوب الفئران المعزولة والمشبعة بـ Langendorff. تعمل هذه الطريقة على تحسين الدقة المكانية مقارنةً بالتقنيات التقليدية، مما يوفر رؤى حول الفيزيولوجيا الكهربية القلبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الفيزيولوجيا الكهربية القلبية
- تقنيات التصوير البصري
- نماذج قلوب الفئران
الخلفية
- يسمح التصوير البصري بالقياس المتزامن لـ Vm و CaT.
- الطرق التقليدية مثل الأقطاب الدقيقة لها قيود في الدقة المكانية.
- يمكن لهذه التقنية المساعدة في التحقيق في تكوين عدم انتظام ضربات القلب.
- يحافظ التغذية الشريانية Langendorff على حيوية القلب للتجارب.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة موثوقة للرسم البصري في قلوب الفئران.
- لتحسين فهم النشاط الكهربائي القلبي.
- لتسهيل البحث في آليات عدم انتظام ضربات القلب.
الطرق المستخدمة
- استئصال قلب الفأر ووضع قسطرة له من أجل التغذية الشريانية.
- استخدام كاميرات عالية السرعة لالتقاط الصور البصرية.
- تحميل الأصباغ البصرية لتصور الإمكانات العابرة للغشاء وتحول الكالسيوم.
- مراقبة درجة الحموضة ودرجة الحرارة أثناء التجربة.
النتائج الرئيسية
- الرسم البصري الناجح لـ Vm و CaT في القلب المعزول.
- تبين تقليل تأثيرات الحركة مع تطبيق الصبغة.
- تسجيل فعال لإمكانات الفعل وإشارات تحول الكالسيوم.
- التحقق من صحة الطريقة لدراسات الفيزيولوجيا الكهربية المستقبلية.
الاستنتاجات
- توفر طريقة التصوير البصري دقة مكانية عالية.
- يمكن لهذه الطريقة أن تتقدم بالبحث في الفيزيولوجيا الكهربية القلبية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه التقنية لاستكشاف تكوين عدم انتظام ضربات القلب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Optical mapping of transmembrane potential and calcium transients in mouse hearts provides high-resolution spatial and temporal data critical for mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. This approach enables quantitative assessment of electrophysiological phenotypes, supporting predictive confidence in preclinical models of arrhythmia and heart failure. By capturing concurrent Vm and CaT dynamics, the method bridges discovery biology with translational biomarker alignment in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping action potential and calcium transient dynamics across cardiac tissue.
- Operational Value: Supports biological de-risking through simultaneous visualization of excitation-contraction coupling parameters.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking molecular perturbations to functional electrophysiological outputs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation via standardized optical signal acquisition.
- Quantitative Outputs: Generates reproducible measurements of action potential duration, conduction velocity, and calcium transient amplitude.
- Scalability: Facilitates platform reuse across multiple cardiac disease models through consistent Langendorff perfusion and dye loading protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studies of heart failure, arrhythmias, and metabolic disease using genetically engineered mouse models.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical validation through preserved tissue architecture and physiological perfusion.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying electrophysiological liability early in the discovery pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical efficacy assessment, enabling iterative refinement of cardiovascular candidates based on functional electrophysiological readouts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by correlating genetic or pharmacological interventions with spatial electrophysiological patterns.
- Screening: Delivers assay standardization and quantitative outputs essential for reliable compound screening in ion channel and modulator discovery.
- Analytics: Provides spatiotemporal measurements of Vm and CaT that enable comparative analysis across experimental conditions and genotypes.
- Translational Research: Maintains physiological relevance through Langendorff perfusion, supporting extrapolation to intact organ responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological phenotyping capability applicable across multiple cardiovascular projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cardiac electrophysiology.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined perfusion, dye loading, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying electrophysiological liabilities prior to significant investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on quantitative action potential and calcium transient profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac dissection, Langendorff perfusion, and optical imaging systems.
- Dependent on high-speed CMOS cameras, excitation light sources, and optical filter sets for dual-channel detection.
- Necessitates cross-team standardization of dye loading protocols and motion artifact reduction strategies.
- Involves adaptation considerations when translating to different mouse strains or disease models with altered cardiac physiology.
- Includes practical limitations such as dye toxicity, photobleaching, and the need for meticulous motion suppression to maintain data quality.
