A Chelex بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من الأنوفيلة النيابة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخراج الملاريا والطفيليات والحمض النووي للبعوض من أقسام الأمعاء الوسطى والغدد اللعابية من الحالات الشاذة والعينات. يتم تحقيق ذلك عن طريق قطع البعوضة أولا بالضبط عند المفصل بين البطن والصدر ، وبالتالي فصل الأمعاء الوسطى عن قسم الغدة اللعابية. بعد ذلك ، يتم طحن كل قسم على حدة في الماء منزوع الأيونات.

ثم يتم وضع تعليق الأنسجة وغسلها واستعادة حبيبات الخلية. أخيرا ، يتم إعادة تكوين حبيبات الخلية وغليها ، ويتم استخراج الحمض النووي. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر طفيليات البعوض والملاريا عالية الجودة ، الحمض النووي ، المناسب للاستخدام كنموذج لتحديد الحالات الشاذة وأنواع النواقل وعدوى الملاريا من النمط الجيني من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل وهضم إنزيم التقييد المحدد للأليل.

لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية البسيطة للغاية على التقنيات الموجودة مثل طرق الاستخراج والفرز العضوية هي أنها تستخدم عددا قليلا جدا من الكواشف الآمنة والمتاحة بسهولة ووقت معالجة أقل بكثير أيضا. لبدء تشريح البعوض ، ضعه على قطعة صغيرة من الطفيلي وقم بتثبيته على مجهر تشريح. قم بتغطيته بقطرة من الماء منزوع الأيونات.

لتنعيم حجم الأنسجة ، فإن جثة البعوض على وجه التحديد في المفصل بين الصدر والبطن. وبالتالي قطع الرأس والصدر من قسم البطن. انقل كل قسم من أقسام البعوض المقطعة إلى جهاز تعقيم نظيف ، وأنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر مسمى مسبقا برقم معرف البعوض وقسم الجسم ، وتخلص من الفيلم الجزئي وباستخدام مسح كيم مبلل بالكحول بنسبة 70٪ ، امسح مرحلة المجهر بعناية قبل معالجتها إلى البعوضة التالية لاستخراج ماصة الحمض النووي للبعوض الأولى 20 ميكرولترا من الماء منزوع الأيونات في أنبوب العينة.

واستخدم طرف الماصة لطحن قسم البعوض المغمور في تعليق موحد. أضف 100 ميكرولتر من الأوتوكلاف ، ومحلول XPBS 1٪ سابونين إلى العينة المتجانسة ودوامة برفق للخلط. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

جهاز الطرد المركزي التالي عند 20،000 جم لمدة دقيقتين ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر واحد XPBS. ثم كرر الدوران.

أضف 75 ميكرولترا من الماء المعقم منزوع الأيونات و 25 ميكرولترا من الوزن بنسبة 20٪ لكل حجم. تعليق راتنج Cellex 100 في الماء منزوع الأيونات ودوامة برفق لإعادة تعليق الحبيبات باستخدام إبرة تحت الجلد معقمة قياس 23 ملتهبة في موقد بنسن. اخترق ثقبا في غطاء أنبوب العينة.

اغلي معلق العينة في كتلة تسخين لمدة 10 دقائق. جهاز الطرد المركزي عند 20 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة ، ونقل محلول الحمض النووي إلى قارورة تخزين مسبقة التصنيف لاستخدامها كقالب في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل للتحقق من جودة الحمض النووي المستخرج ، وتضخيم منطقة من المفصليات mi نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد نازعة هيدروجين الوحدة الفرعية الرابعة من الجين الذي من المتوقع أن ينتج 400 جزء من زوج القاعدة. بجانب التفريق بين أنواع Ananais Gambia ، قم بتضخيم منطقة تحيط بتعدد الأشكال في منطقة الفاصل بين الجينات والتي من المتوقع أن تنتج أحجاما من 390 زوجا أساسيا ل Ananais Gambia Sens Stricto ، و 315 زوجا أساسيا ل ananais api.

ثم إلى النمط الجيني p المنجل المضاد للحمض الفوليك تعدد الأشكال المقاومة للأدوية. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل لتضخيم المنطقة التي تحيط بكدونات الأحماض الأمينية 16 و 51 و 59 و 108 و 164. في الطفيليات ، يقوم جين اختزال حمض الفوليك ثنائي هيدرو بإجراء هضم أليل محدد للأمبليكون للكشف عن مقاومة الأدوية المضادة لحمض الفوليك.

تعدد الأشكال المرتبطة. تحقق من ردود الفعل في اختبار هلام AROS 2٪. تظهر أمثلة على النتائج من فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل لجودة مستخلص الحمض النووي للبعوض التعريف الجزيئي RABIS ، والتنميط الجيني p المنجلي أن طريقة Kelex المبسطة تعطي نتائج مماثلة لبروتوكول التمليح القياسي على الرغم من خطوات أقل وأقل من ربع الوقت مع جودة الحمض النووي المماثلة في المستخلصات المعنية ، فليس من المستغرب أن معدلات إيجابية العينة فيما يتعلق بالحالات الشاذة ، لم تكن الأنواع الشقيقة في غامبيا ، وكذلك معدلات الإصابة بالطفيليات مختلفة إحصائيا بناء على اختبار ماكنير تشي سكوير.

إضافة BSA إلى مخاليط التفاعل إلى زيادة عامة في إيجابيات تفاعل البوليميراز المتسلسل بسبب إزالة مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل من بروتوكول التمليح المبسط والمنتظم. ومع ذلك ، لم تكن هذه الزيادة ذات دلالة إحصائية باستثناء جودة الحمض النووي على مستخلصات kelex. يتيح هضم إنزيم تقييد الأليل الخاص ب p falciparum amplicon التنميط الجيني لالتهابات الملاريا في الأمعاء الوسطى والغدد اللعابية لأليلات مقاومة الأدوية بمجرد إتقانها.

يجب أن تكون هذه التقنية قابلة للتنفيذ في حوالي 37 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.