A Chelex بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من الأنوفيلة النيابة.
يناير 9, 2013
يوصف وسيلة سريعة وبأسعار معقولة لاستخراج نوعية طفيل الملاريا وناقلات DNA من عينات البعوض. الاستفادة من خصائص مخلبية من راتنج Chelex، وطريقة بسيطة تمكن من التنميط الجيني طفيليات الملاريا في البعوض مراحل الغدة منتصف القناة الهضمية واللعابية، وكذلك تحديد الجزيئي لل الأنوفيلة الشقيق الأنواع من PCR.
الهدف العام من هذا الإجراء هو استخراج الملاريا والطفيليات والحمض النووي للبعوض من أقسام الأمعاء الوسطى والغدد اللعابية من الحالات الشاذة والعينات. يتم تحقيق ذلك عن طريق قطع البعوضة أولا بالضبط عند المفصل بين البطن والصدر ، وبالتالي فصل الأمعاء الوسطى عن قسم الغدة اللعابية. بعد ذلك ، يتم طحن كل قسم على حدة في الماء منزوع الأيونات.
ثم يتم وضع تعليق الأنسجة وغسلها واستعادة حبيبات الخلية. أخيرا ، يتم إعادة تكوين حبيبات الخلية وغليها ، ويتم استخراج الحمض النووي. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر طفيليات البعوض والملاريا عالية الجودة ، الحمض النووي ، المناسب للاستخدام كنموذج لتحديد الحالات الشاذة وأنواع النواقل وعدوى الملاريا من النمط الجيني من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل وهضم إنزيم التقييد المحدد للأليل.
لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية البسيطة للغاية على التقنيات الموجودة مثل طرق الاستخراج والفرز العضوية هي أنها تستخدم عددا قليلا جدا من الكواشف الآمنة والمتاحة بسهولة ووقت معالجة أقل بكثير أيضا. لبدء تشريح البعوض ، ضعه على قطعة صغيرة من الطفيلي وقم بتثبيته على مجهر تشريح. قم بتغطيته بقطرة من الماء منزوع الأيونات.
لتنعيم حجم الأنسجة ، فإن جثة البعوض على وجه التحديد في المفصل بين الصدر والبطن. وبالتالي قطع الرأس والصدر من قسم البطن. انقل كل قسم من أقسام البعوض المقطعة إلى جهاز تعقيم نظيف ، وأنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر مسمى مسبقا برقم معرف البعوض وقسم الجسم ، وتخلص من الفيلم الجزئي وباستخدام مسح كيم مبلل بالكحول بنسبة 70٪ ، امسح مرحلة المجهر بعناية قبل معالجتها إلى البعوضة التالية لاستخراج ماصة الحمض النووي للبعوض الأولى 20 ميكرولترا من الماء منزوع الأيونات في أنبوب العينة.
واستخدم طرف الماصة لطحن قسم البعوض المغمور في تعليق موحد. أضف 100 ميكرولتر من الأوتوكلاف ، ومحلول XPBS 1٪ سابونين إلى العينة المتجانسة ودوامة برفق للخلط. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
جهاز الطرد المركزي التالي عند 20،000 جم لمدة دقيقتين ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر واحد XPBS. ثم كرر الدوران.
أضف 75 ميكرولترا من الماء المعقم منزوع الأيونات و 25 ميكرولترا من الوزن بنسبة 20٪ لكل حجم. تعليق راتنج Cellex 100 في الماء منزوع الأيونات ودوامة برفق لإعادة تعليق الحبيبات باستخدام إبرة تحت الجلد معقمة قياس 23 ملتهبة في موقد بنسن. اخترق ثقبا في غطاء أنبوب العينة.
اغلي معلق العينة في كتلة تسخين لمدة 10 دقائق. جهاز الطرد المركزي عند 20 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة ، ونقل محلول الحمض النووي إلى قارورة تخزين مسبقة التصنيف لاستخدامها كقالب في تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل للتحقق من جودة الحمض النووي المستخرج ، وتضخيم منطقة من المفصليات mi نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد نازعة هيدروجين الوحدة الفرعية الرابعة من الجين الذي من المتوقع أن ينتج 400 جزء من زوج القاعدة. بجانب التفريق بين أنواع Ananais Gambia ، قم بتضخيم منطقة تحيط بتعدد الأشكال في منطقة الفاصل بين الجينات والتي من المتوقع أن تنتج أحجاما من 390 زوجا أساسيا ل Ananais Gambia Sens Stricto ، و 315 زوجا أساسيا ل ananais api.
ثم إلى النمط الجيني p المنجل المضاد للحمض الفوليك تعدد الأشكال المقاومة للأدوية. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل لتضخيم المنطقة التي تحيط بكدونات الأحماض الأمينية 16 و 51 و 59 و 108 و 164. في الطفيليات ، يقوم جين اختزال حمض الفوليك ثنائي هيدرو بإجراء هضم أليل محدد للأمبليكون للكشف عن مقاومة الأدوية المضادة لحمض الفوليك.
تعدد الأشكال المرتبطة. تحقق من ردود الفعل في اختبار هلام AROS 2٪. تظهر أمثلة على النتائج من فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل لجودة مستخلص الحمض النووي للبعوض التعريف الجزيئي RABIS ، والتنميط الجيني p المنجلي أن طريقة Kelex المبسطة تعطي نتائج مماثلة لبروتوكول التمليح القياسي على الرغم من خطوات أقل وأقل من ربع الوقت مع جودة الحمض النووي المماثلة في المستخلصات المعنية ، فليس من المستغرب أن معدلات إيجابية العينة فيما يتعلق بالحالات الشاذة ، لم تكن الأنواع الشقيقة في غامبيا ، وكذلك معدلات الإصابة بالطفيليات مختلفة إحصائيا بناء على اختبار ماكنير تشي سكوير.
تؤديإضافة BSA إلى مخاليط التفاعل إلى زيادة عامة في إيجابيات تفاعل البوليميراز المتسلسل بسبب إزالة مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل من بروتوكول التمليح المبسط والمنتظم. ومع ذلك ، لم تكن هذه الزيادة ذات دلالة إحصائية باستثناء جودة الحمض النووي على مستخلصات kelex. يتيح هضم إنزيم تقييد الأليل الخاص ب p falciparum amplicon التنميط الجيني لالتهابات الملاريا في الأمعاء الوسطى والغدد اللعابية لأليلات مقاومة الأدوية بمجرد إتقانها.
يجب أن تكون هذه التقنية قابلة للتنفيذ في حوالي 37 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة سريعة وبأسعار معقولة لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة من طفيليات الملاريا ومتجهات البعوض. باستخدام راتنج Chelex، تتيح هذه التقنية التنميط الجيني الفعّال لطفيليات الملاريا والتعريف الجزيئي لأنواع البعوض من جنس Anopheles.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- علم الجينوم
الخلفية
- الملاريا هي مشكلة صحية عالمية كبيرة، تنقلها بعوض من جنس Anopheles.
- تعتبر طرق استخراج الحمض النووي التقليدية مضيعة للوقت وتتطلب كواشف خطرة.
- هناك حاجة لتقنيات أبسط، وأكثر أمانًا، وأكثر فعالية لاستخراج الحمض النووي.
- تقدم هذه الدراسة طريقة تلبي هذه الاحتياجات باستخدام راتنج Chelex.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي من طفيليات الملاريا ومتجهات البعوض.
- تمكين التنميط الجيني لطفيليات الملاريا وتعريف أنواع البعوض من جنس Anopheles.
- مقارنة كفاءة وفعالية الطريقة الجديدة بالبروتوكولات التقليدية.
الطرق المستخدمة
- تشريح عينات البعوض لفصل أقسام الأمعاء الوسطى والغدد اللعابية.
- طحن الأنسجة في الماء غير المؤين لإنشاء محلول.
- استخدام راتنج Chelex لاستخراج الحمض النووي.
- تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للتنميط الجيني وتحديد الأنواع.
النتائج الرئيسية
- تنتج طريقة Chelex حمض نووي عالي الجودة مناسب لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
- النتائج قابلة للمقارنة بالطرق التقليدية مع وقت معالجة أقل بشكل كبير.
- كانت معدلات إيجابية العينات لتحديد الأنواع والتهابات الطفيليات متشابهة إحصائيًا بين الطرق.
- أدى إضافة BSA إلى تحسين نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عن طريق تقليل المثبطات.
الاستنتاجات
- طريقة Chelex المبسطة فعالة لاستخراج الحمض النووي من ناقلات الملاريا.
- يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من 40 دقيقة، مما يجعلها عملية للاستخدام الروتيني.
- توفر طريقة أكثر أمانًا وفعالية من الطرق التقليدية لاستخراج الحمض النووي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
In resource-limited settings, sustainable molecular surveillance of malaria vectors and parasites requires DNA extraction methods that balance performance with operational simplicity. The Chelex-based protocol delivers comparable DNA quality to established salting-out methods while reducing reagent complexity and processing time from nearly three hours to under 40 minutes. This positions the method as a practical tool for enabling scalable, cost-effective genotyping and species identification workflows in endemic region research and control programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vector-parasite interactions by providing DNA templates for species confirmation and infection status assessment.
- Operational Value: Reduces hands-on time and reagent burden, supporting higher throughput in field-collected sample processing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces DNA suitable for PCR-based assays targeting vector species discrimination and parasite genotyping.
- Operational Value: Uses only three reagents (deionized water, saponin, Chelex resin), enhancing assay standardization and reducing variability in resource-constrained labs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from vector collection to downstream applications like drug resistance genotyping via nested PCR and restriction digestion.
- Operational Value: Eliminates need for hazardous organic solvents, improving safety and accessibility in field laboratories.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from specimen processing to genetic analysis, enabling reliable input for PCR-based identification and genotyping assays.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on vector species distribution and Plasmodium falciparum infection rates in field settings.
- Screening: Delivers DNA extracts with sufficient quality and yield for multiplex PCR applications, supporting assay readiness.
- Analytics: Enables quantitative assessment via PCR amplification of ND4, species-specific SNPs, and drug resistance loci, allowing comparison across sample groups.
- Translational Research: Connects entomological surveillance to parasite genotyping, supporting risk-adjusted decisions in malaria control strategies.
- Enterprise Reuse: Protocol simplicity and minimal equipment needs (microcentrifuge, heating block) allow adoption across multiple field sites and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in vector species identification and parasite detection through comparable sensitivity and specificity to benchmark methods.
- Operational Value: Achieves high reproducibility with minimal reagent dependency, reducing supply chain vulnerability in remote settings.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in surveillance programs by shortening time-to-result for molecular confirmation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of interventions by delivering timely, accurate data on vector competence and parasite prevalence.
Implementation Considerations
- Requires basic molecular biology training for tissue dissection, homogenization, and PCR setup.
- Needs access to a microcentrifuge capable of 20,000 × g and a heating block for boiling step.
- Standardization across teams benefits from consistent vortexing and pipetting techniques during homogenization and resin resuspension.
- Adaptation to other mosquito species or sample types may require validation of lysis efficiency and inhibitor removal.
- Practical limitation: The method includes a manual grinding step that may limit ultra-high-throughput automation without modification.
