عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الـ RNA الكلي لبكتيريا Pseudomonas aerogen المستخلصة من الخلايا الظهارية المخاطية (ECMs) للفئران. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع محتويات اللمعة التتابعية، ثم يتم عزل الـ RNA البكتيري.

بعد ذلك، يتم إجراء معالجة D'S وتنقية الـ RNA. وأخيرًا، يتم تقدير كمية الـ RNA والتحقق من نقاء العينة المعزولة باستخدام جهاز bioanalyzer والتحليل الطيفي الضوئي. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على RNA بكتيري بجودة وكمية كافيتين لإجراء التقييمات التجريبية اللاحقة، مثل QPCR، أو التحليل، أو توصيف النسخ، أو تجارب تسلسل الـ RNA.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل استخلاص التريول، في أن هذه الطريقة تدمج خطوات تحلل متعددة في حمض صارم للغاية، وخطوات استخلاص بالكلوروفورم لضمان الحصول على RNA عالي الجودة. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات التحلل والاستخلاص يصعب تعلمها، نظراً لأن البروتوكولات المكتوبة تغفل تفاصيل صغيرة حاسمة للنجاح. سيقوم بتوضيح الإجراء إدواردو لوبيز مدينا، وهو زميل ما بعد الدكتوراه، وميجان نيوباور، مديرة المختبر، وكلاهما من مختبري. وقبل البدء في الحصاد، تقوم IMSA بتنظيف الهاون المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ في حمام من النيتروجين السائل.

بعد ذلك، وبعد القتل الرحيم لفأر C3 HHEN بعمر ستة إلى ثمانية أسابيع مستعمر بـ pseudomonas aerogen، يوضع الحيوان في وضعية الاستلقاء الظهري على لوح من البوليستيرين ويتم رش البطن بـ 95%ethanol. بعد ذلك، يتم إجراء شق طولي في خط المنتصف عبر الجلد من القص إلى العجان. ثم يتم سحب الجلد والبريتون وكشف التجويف البطني.

الآن، قم باستئصال الأعور بالكامل باستخدام الملقط. أمسك الأعور فوق الهاون المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ، ثم قص كلا طرفي الأعور باستخدام مقص التشريح. املأ طرف ماصة P 1000 بمقدار 1 mL من محلول sequel flush eight buffer، ثم أدخل الطرف في النهاية القريبة من الأعور.

قم بتفريغ محتويات مخزن التخزين المؤقت "sequel flush eight" والمحتويات اللمعية "sequel luminal" في هاون من الفولاذ المقاوم للصدأ. الآن، قم بطحن محتويات "sequel flush eight" باستخدام مدقة معقمة.

بعد ذلك، صب الإيثانول في وعاء يحتوي على الثلج الجاف، وضع أنبوباً مخروطياً من البولي بروبيلين سعة 50 milliliter في حمام الإيثانول والثلج الجاف. انقل محتويات اللمعة المجمدة والمطحونة إلى الأنبوب المخروطي، ثم خزن الأنبوب عند درجة حرارة minus 80 °C. وتعد سلسلة الخطوات التالية هي الأكثر دقة وصعوبة في هذا الإجراء.

نظراً للطبيعة المعقدة للمواد المستخلصة من الأعور في الفأر المصاب بالعدوى (MI)، فإن عمليات الاستخلاص المتكررة باستخدام الخيوط الباردة (cold filoform) ضرورية للغاية لتحقيق مستوى مقبول من التساوي والسلامة؛ إذ قد يتطلب الأمر من ثلاث إلى خمس عمليات استخلاص قبل القضاء على الواجهة العريضة بين الأطوار المائية والعضوية. انقُل حجماً واحداً من الفينول الحمضي والكلوروفورم إلى أنبوب طرد مركزي Oak Ridge سعة 50 ملليلتر. أحكم إغلاق الغطاء بإحكام، ثم قم بتدفئة الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 65 °C.

ضع نصف حجم من محلول التحلل (lysis buffer) في أنبوب مخروطي من البولي بروبيلين سعة 50 ملليلتر، ثم قم بغلي المحلول لمدة خمس دقائق. بعد إخراج محتويات التجويف اللمعي (luminal contents) للتسلسل من التخزين عند درجة حرارة -80 درجة مئوية، قم بتدفئة الأنبوب لفترة وجيزة عن طريق فركه بسرعة باليد، ثم أضف محلول التحلل المغلي إلى الأنبوب. رج المزيج لضمان تجانس محلول محتويات التجويف اللمعي مع محلول التحلل.

قم بغلي منظم التحلل ومحتويات SQL luminal لمدة خمس دقائق. وباستخدام جهاز الرج (vortex) بشكل دوري، قم بفتح أنبوب طرد مركزي Oak Ridge الذي يحتوي على محلول الفينول كلوروفورم، وانقل عينة التحلل من محتويات SQL إلى الأنبوب. بعد ذلك، أعد إغلاق الغطاء بإحكام باستخدام perfil وضع الأنبوب مرة أخرى في حمام مائي عند درجة حرارة 65 °C لمدة 10 دقائق، مع رج الأنبوب كل دقيقتين.

اغسل العينة عند 2,500 ×g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. الآن، انقل الطور المائي بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد من نوع Oak Ridge سعة 50 مل، مع تجنب أي جزء من الواجهة البيضاء. ثم أضف حجماً مساوياً من الكلوروفورم والفينول الحمضي إلى الأنبوب الجديد.

أحكم إغلاق الغطاء باستخدام فيلم التغليف (perfil) واخلط المحتويات جيداً عن طريق رج الأنبوب بجهاز الفورتكس (vortex) بسرعة عالية. استمر في طرد العينة مركزياً ونقل الطور المائي إلى أنبوب الطرد المركزي. إذا أصبح حجم الطور المائي العلوي صغيراً جداً، يمكن نقله إلى أنبوب ذو قطر أصغر.

استمر في هذه العملية حتى لا يتبقى واجهة بيضاء مرئية بين الطورين المائي والعضوي. وعندما تختفي الواجهة البيضاء، انقل الطور المائي بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد. ثم أضف حجماً مساوياً من الكلوروفورم وكحول الإيزواميل إلى الأنبوب، وأغلق الغطاء بإحكام، ثم امزج المحتويات جيداً باستخدام جهاز المزج الدوامي (vortexing).

بعد ذلك، وبعد طرد العينة مركزياً مرة أخرى، انقل الطور المائي إلى أنبوب مخروطي من البولي بروبيلين سعة 15 milliliter وأضف حجماً مساوياً من الإيزوبروبانول. ثم قم بحضن المحلول عند درجة حرارة minus 20 degrees Celsius لمدة ساعتين على الأقل أو طوال الليل. بعد حضن العينة، قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة 45 minutes.

بعد تحديد الراسب الشبيه بالهلام في قاع الأنبوب، قم بإزالة السائل الطافي. الآن، اغسل الراسب بـ 1 mL من الإيثانول 70% المبرد بالثلج عن طريق رج الأنبوب بجهاز vortexting، ثم قم بطرد العينة مركزياً بسرعة 10,000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. وأخيراً، قم بإزالة السائل الطافي واقلب الأنبوب للسماح للراسب بالجفاف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بإعادة تعليق كتلة الـ RNA في 200 µL من الماء الخالي من الـ RNA. أولاً، أضف 20 µL من منظم turbo DNA بتركيز 10x ومقدار 2 µL من turbo DNA إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وامزج المحلول برفق. ثم قم بحضن الأنبوب عند 37 °C لمدة 20 دقيقة، وبعد ذلك أضف 20 µL من كاشف تثبيط الـ DNA المعاد تعليقه إلى الأنبوب وامزجه جيداً.

الآن، قم بحضن الأنبوب لمدة خمس دقائق إضافية في درجة حرارة الغرفة مع التقليب من حين لآخر. بعد ذلك، قم بترسيب الراسب في جهاز طرد مركزي دقيق بسرعة 10,000 ×g لمدة 1.5 دقيقة، ثم انقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. أضف حجماً واحداً من الكلوروفورم والفينول الحمضي البارد إلى الراسب، ثم امزج المحلول جيداً باستخدام جهاز الرج vortex لمدة دقيقة واحدة.

بعد طرد المحلول مركزياً لمدة دقيقتين عند 12,500 ×g، يتم نقل الطور المائي إلى أنبوب جديد وإضافة حجم واحد من مزيج الكلوروفورم وكحول الأيزواميل. ثم يُمزج المحلول باستخدام جهاز المرج (vortex)، وبعد ذلك يُطرد المحلول مركزياً مرة أخرى تحت نفس الظروف. أخيراً، يُنقل الطور المائي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

ثم أضف 0.1 حجم من أسيتات الصوديوم بتركيز ثلاثة مولار و 2.5 حجم من الإيثانول بتركيز 100% والمبرد بالثلج. قم برج الأنبوب باستخدام جهاز Vortex للمزج. قم بتحضين العينة عند درجة حرارة -80 °C لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، يتم الطرد المركزي عند 12,000 ×g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، ثم يتم إزالة السائل الطافي. وأخيرًا، اغسل الراسب باستخدام 1 mL من الإيثانول 70% المبرد بالثلج. أزل السائل الطافي واترك الراسب ليجف في الهواء لمدة 10 دقائق.

ثم أعد تعليق الراسب في 100 µL من الماء الخالي من RNase. يُعد جهاز Agilent Bioanalyzer منصة تعتمد على الموائع الدقيقة لتحديد الحجم والقياس الكمي ومراقبة جودة DNA وRNA والبروتينات والخلايا، ويستخدم مقياساً لسلامة RNA يُعرف باسم رقم سلامة RNA أو RIN. وتنتج العينات المستخلصة بهذا البروتوكول نسب 260/280 تتراوح من 1.7 إلى 2.0 وقيم RIN أكبر من أو تساوي 7.0.

يظهر هنا على اليسار مثال لمخطط الفصل الكهربائي (electropherogram) الخاص بـ Agilent bioanalyzer للحمض النووي الريبوزي (RNA) البكتيري، وتظهر على اليمين صورة شبيهة بالهلام لـ pseudomonas arosa المستخلصة من محتويات SQL الفئران. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) أو تسلسل الـ RNA من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التنميط الدقيق للتعبير الجيني.