إنشاء فيروس ابشتاين بار النمو وتحولت خطوط الخليوي Lymphoblastoid

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج خطوط خلوية من الخلايا اللمفاوية المتحولة بفيروس إبشتاين-بار (LCL) من الخلايا البائية البشرية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الخلايا أحادية النواة من الدم المحيطي من دم بشري.

بعد ذلك، يتم إصابة الخلايا بفيروس Epstein-Barr بوجود FK 5 0 6 وعوامل مثبطة للمناعة؛ وبعد ثلاثة إلى أربعة أيام من الإصابة بفيروس Epstein-Barr، تظهر مجموعة فرعية من الخلايا تتميز بأنها CD 23 high وCD 58 positive، ويُتوقع أن تخضع للتكاثر. يمكن تعداد الخلايا ذات الخصائص CD 23 high وCD 58 positive عن طريق قياس التدفق الخلوي كمتنبئ بالنتيجة الناجحة. كما يمكن تحديد الخلايا المتكاثرة بشكل أكبر، مجهرياً وعيانياً، من خلال تجمعات خطوط الخلايا lymphoblasts التي تتشكل في المزارع الخلوية التي تحولت بنجاح.

تتمثل الخطوة النهائية في توسيع خطوط خلايا الليمفوبلاست من أجل الحفظ بالتجميد. نقوم في مختبري بإنشاء خطوط خلايا الليمفوبلاست أو LCLs لفهم التفاعلات بين المضيف وفيروس Epstein-Barr. كما تحظى خطوط خلايا الليمفوبلاست باهتمام عام واسع من قبل المجتمع العلمي، لا سيما علماء الفيروسات والمناعة وعلماء بيولوجيا السرطان.

بصفتي زميلاً لما بعد الدكتوراه في مختبر Macintosh، سأقوم بشرح إجراء توليد الخطوط الخلوية من الخلايا الليمفاوية الأرومية. بعد سحب 10 milliliters من الدم من متبرع، أضف الدم المعالج بالهيبارين إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter، ثم قم بتخفيفه بنسبة واحد إلى اثنين. من خلال إضافة 20 milliliters من محلول PBS بدرجة حرارة الغرفة إلى الأنبوب، قم الآن بوضع 15 milliliters من وسط فصل الخلايا الليمفاوية FICO HIA تحت الدم المخفف، ثم قم بطرد الدم مركزياً عند 225 ×g بدون استخدام المكبح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لإنشاء تدرج كثافة.

بعد ذلك، قم بإزالة الطبقة البيضاء (buffy coat) ونقلها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliter. أكمل الحجم إلى 50 milliliters باستخدام PBS، ثم قم بترسيب الخلايا عند 600 ×g لمدة 10 minutes. صُب السائل الطافي، ثم أعد تعليق الراسب في 50 milliliters من PBS، وبعد ذلك اغسل الخلايا مرتين إضافيتين تحت نفس الظروف.

الآن، أعد تعليق الخلايا في 1 mL من وسط RPMI الكامل. أستخدم 5 µL من الخلايا لإجراء تخفيف بنسبة 1 إلى 10 في صبغة tripan blue، ولعدّ الخلايا الحية باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ثم استخدم وسط RPMI الكامل لضبط الحجم للحصول على تركيز خلوي يبلغ 2×10⁶ خلية لكل mL، وانقل الخلايا إلى قارورة زراعة أنسجة بمساحة 25 cm².

لتحضير الخلايا للإصابة بفيروس Epstein-Barr، أضف FK 506 إلى قارورة زراعة الأنسجة بتركيز نهائي قدره 20 µM. بعد ذلك، ضع القارورة في حضانة تحتوي على 5% carbon dioxide عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة. عندما تقترب عملية التحضين من الانتهاء، قم بإذابة جزء من فيروس Epstein-Barr بسرعة، والذي تم حصاده من خلايا B 95 8. ثم أخرج القارورة من الحضانة وأضف فيروس Epstein-Barr إلى الخلايا بتخفيف 1:10؛ الآن قم برج القارورة لخلط فيروس Epstein-Barr في المحلول، ثم ضع القارورة في وضع عمودي داخل الحضانة مع إغلاق الغطاء، ولكن مع تركه مرتخياً قليلاً في حال استخدام قارورة غير مهواة، وذلك لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع قبل توسيع المزرعة لغرض الحفظ بالتجميد.

بعد أسبوع من الـ eps، وهي العدوى بفيروس Epstein Barr، تظهر تجمعات من الخلايا تحت المجهر الضوئي كما هو موضح في هذا الشكل التمثيلي للتجمعات المجهرية المبكرة. ومع مرور الوقت، يزداد حجم هذه التجمعات المجهرية، بحيث تصبح الكتل مرئية عيانياً في القارورة كما يظهر في هذا الشكل حيث يمكن ملاحظة تجمعات أكبر من LCL عند تغذية الخلايا، مع مضاعفة حجم الوسط الداعم في قارورة الزراعة في اليوم 12. عندما يتحول لون وسط الزراعة إلى اللون الأصفر، وهو ما يحدث عادةً مرة واحدة في الأسبوع تقريباً، يكون ذلك في الغالب الوقت المناسب لتغذية الخلايا من أجل توسيعها، وزيادة حجم المزرعة بمقدار ضعفين إلى ثلاثة أضعاف.

باستخدام وسط RPMI الكامل، قم بتوسيع المزرعة لتصل إلى 70 إلى 100 مليلتر في دورق مربع سعة 75 سنتيمتر على مدار الأسابيع القليلة القادمة لإنتاج خلايا مخصصة للحفظ بالتجميد، ويمكن التنبؤ بالنتيجة الناجحة من خلال وجود خلايا موجبة لـ CD 23 وCD 58 بنسبة عالية كما يظهر في هذا المخطط المبعثر، حيث يمتلك ما يقرب من 2 إلى 3% من الخلايا الحية في اليوم الثالث إلى الرابع بعد التعرض لفيروس Epstein-Barr هذا المقطع الظاهري، بينما تُظهر المجموعات الفرعية الأخرى من الخلايا الموجبة لـ CD 23، أو السالبة لـ CD 23، أو الموجبة لـ CD 58، أو السالبة لـ CD 58 التي لوحظت بعد التعرض لفيروس Epstein-Barr تكاثراً ضئيلاً، كما أن الخلايا غير المصابة أو الخلايا المصابة بسلالة غير مخلدة من فيروس Epstein-Barr لا تُظهر ارتفاعاً في CD 23.

خلايا موجبة لـ CD 58. يمكن أيضاً رؤية الخلايا باستخدام المجهر الضوئي. وكما ذكرنا، فإنه خلال أسبوع من الإصابة بفيروس Epstein-Barr، تظهر تجمعات صغيرة من الخلايا في الدورق عند الفحص بالمجهر الضوئي.

مع مرور الوقت وتطور الخلايا إلى LCL، تصبح التجمعات المجهرية أكبر، بحيث تظهر الكتل مرئية عيانياً في القارورة. حسناً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا أحادية النواة من الدم المحيطي من دم الإنسان، وكيفية توليد خطوط خلوية من الخلايا الليمفاوية المنفجرة المحولة بفيروس Epstein-Barr من الخلايا B البشرية، بينما تم وصف توليد خطوط الخلايا الليمفاوية المنفجرة من قبل مختبرات أخرى.

تكمن ميزة البروتوكول الخاص بنا في أنه يوفر للباحثين طريقة للتنبؤ بالنتيجة الناجحة في وقت مبكر يتراوح بين ثلاثة إلى أربعة أيام بعد إصابة الخلايا البائية بفيروس Epstein-Barr.