رصد اليوبيكويتين-proteasome نشاط في الخلايا الحية باستخدام Degron (DGN)-زعزعة استقرار الأخضر نيون البروتين البروتين مراسل (GFP) على أساس

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس نشاط البروتيزوم في الخلايا الحية باستخدام بروتين اندماجي من GFP Deron. أولاً، يتم استنساخ قليلات النوكليوتيد المخصصة لـ Deron وDeron frameshift. أدخل ناقل P-E-G-F-P-C one وتابع البروتوكولات الخاصة بنظام gateway من Vitrogen، ثم أنتج الفيروسات لكل بناء باستخدام خلايا HEK 2 93 FT. بعد تحديد العيار، يتم تحويل الخلايا باستخدام الفيروس وتطبيق الانتقاء بالمضادات الحيوية، ثم يتم توسيع الخلايا المستقرة الناتجة والمعبرة عن GFP DRON أو GFP Dron frameshift.

تسهل هذه التقنية إجراء التجارب التي تراقب استجابات الخلايا لمعالجات معينة من خلال قياسات إشارات الفلورة. فعلى سبيل المثال، يمكن تقييم نشاط البروتيازوم بسهولة باستخدام الفلورة فوق المجهرية (epi fluorescence) أو قياس التدفق الخلوي (flow cytometry). وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المقايسات المضيئة أو الفلورية التي تستخدم أحماض نووية للخلايا الكاملة، في أن نشاط البروتيازوم يتم قياسه في خلايا حية. ومن أجل عملية ترنسفكشن (transfection)، يتم تخفيف 36 µL من كاشف lipo 2000 في 1.5 mL من وسط DMEM، وفي أنبوب فالكون آخر سعة 15 mL، يتم تخفيف بنى DNA في 1.5 mL من وسط DMEM.

بعد خمس دقائق، ادمج المكونين معًا واحضنهما لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الآن، استبدل الوسط في مستنبت متراص من خلايا HEK 2 93 FT في دورق T 75 بسبعة ملليلترات من DMEM. ثم أضف خليط DNA lipo إلى الدورق واخلطه عن طريق تحريكه ذهابًا وإيابًا.

يُحضن الدورق طوال الليل عند درجة حرارة 37 °C في حاضنة تحتوي على 5%CO2. وفي اليوم التالي، يُستبدل الوسط بـ 10 milliliters من DMEM. وبعد 48 ساعة، يتم جمع الراشح، ثم يُفلتر الراشح المحتوي على الفيروس باستخدام مرشح PVDF بمسامية 0.45 micrometer.

لتركيز الفيروس، أضف حجماً واحداً من محلول PEG إلى أربعة أحجام من السائل الطافي واحضن المزيج لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C مع التقليب الدوري عن طريق القلب. قم بحصد الفيروس باستخدام الطرد المركزي، وبعد سحب الـ SNA من الراسب الأبيض، قم بالطرد المركزي مرة أخرى لإزالة أي محلول PEG متبقٍ. أعد تعليق الراسب النهائي في PBS باستخدام الماصة، ثم قم بالرج القوي باستخدام جهاز vortex لمدة 20 إلى 30 ثانية.

قم بتخزين حصص مقدارها 100 µL من الفيروس عند درجة حرارة -80 °C. قم باستزراع خلايا U2 OS في أطباق ذات ستة آبار واحضنها طوال الليل. لإجراء عملية عفن transfection، استبدل وسط الزرع بـ 1 mL من DMEM يحتوي على 8 µg/mL من Polybrenan. خصص بئراً واحداً كعينة ضابطة موجبة واختبر سلسلة من تركيزات الفيروس في الآبار المتبقية.

يتم التحضين طوال الليل في اليوم التالي. استبدل الوسط بـ 2 mL من DMEM وحضن الخلايا لمدة 24 ساعة. ابدأ عملية الانتخاب باستخدام 10 µg/mL من blasticidin، واستمر في استبدال الوسط المحتوي على المضاد الحيوي كل يومين.

بعد حوالي ستة إلى سبعة أيام، تحقق من موت الخلايا غير المنقولة. بعد ذلك، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لصبغ الخلايا. غطِّ الخلايا بالبنفسجي البلوري (crystal violet) واحضنها لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم اسحب الصبغة، واشطف الآبار مرتين بالماء المقطر المزدوج، واترك الطبق ليجف في الهواء.

أخيراً، قم بعدّ المستعمرات لحساب وحدات ترانسفكشن الفيروس لكل مليلتر. يتم استزراع الخلايا الليفية الدبلوئية البشرية (Human diplo fibroblasts) في أطباق ذات ستة آبار باستخدام 8 µg/mL من Polybrain كمحفز للنقل الجيني.

استخدم تعدد عدوى يبلغ 2 في حجم إجمالي قدره 1 mL. قم بتغيير الوسط. وفي اليوم التالي، عندما تصل درجة تلاقي المزارع إلى 70 إلى 80%.

ابدأ عملية الانتقاء المزمن بتركيز 10 micrograms/mL. على مدار عدة أيام، راقب موت الخلايا المكتمل الذي يشير إلى تمام عملية الانتقاء. قم بتكثير الخلايا التي تم نقل الجينات إليها بشكل مستقر لإنتاج خط خلوي مستقر يعبر عن بروتينات الاندماج GFP DERON أو GFP Deron Frameshift. ابدأ بزراعة الخلايا التي تحمل إما GFP DRON أو GFP DRON frameshift، وفي اليوم التالي، قبل ثلاث ساعات من عملية التثبيت.

عالج الخلايا الضابطة بمثبط البروتوزوم. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ثم اجمع الخلايا باستخدام 0.5 milliliters من التريبسين. لإيقاف مفعول التريبسين.

استخدم 4.5 milliliters من وسط الزرع وانقل الخلايا إلى أنبوب Falcon سعة 15 milliliter. يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وبعد غسلها مرة واحدة بمحلول PBS، أعد تعليق الراسب في 400 microliter من منظم fax. انقل الخلايا إلى أنابيب fax وضعها على الثلج.

قم الآن بقياس العينات باستخدام قياس التدفق الخلوي. يحمل بروتين الاندماج GFP Deron تسلسلاً يستهدفه البروتيازوم للتحلل الفوري. وفي المقابل، لا يتحلل الطافر GFP Deron FS الناتج عن إزاحة الإطار بواسطة البروتيازومات.

وبناءً على ذلك، عند نقل GFP Deron إلى الخلايا الليفية البشرية الشابة المستخدمة والتي يتوقع أن يكون لديها نشاط بروتيزومي عالٍ، تظهر إشارة فلورية منخفضة تحت مجهر الفلورة فوق البنفسجية (epi fluorescence). بينما تظهر الخلايا نفسها عند نقل GFP Deron Frameshift إليها نسبة 39.7% من الخلايا الإيجابية. ويؤدي علاج الخلايا بمثبط البروتيزوم ll و L إلى زيادة الإشارات لتصل إلى حد أقصى يبلغ حوالي 63% في كل من خلايا GFP dron وخلايا GFP Dron frameshift.

تُظهر قياسات مماثلة في الخلايا الليفية الجلدية، التي عُزلت من متبرعين شباب وفي منتصف العمر وكبار السن، زيادة واضحة في إشارة GFP بين الأفراد الشباب والمتبرعين في منتصف العمر، مما يشير إلى انخفاض في نشاط البروتيازوم في العينات التي تم الحصول عليها من المتبرعين المسنين. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج جسيمات الفيروسات البطيئة، ونقل الجينات إلى الخلايا، وتحديد نشاط البروتيازوم في الخلايا الحية.