بناء منخفض الميزانية Axotomy نظام ليزر لدراسة التجديد في أكسون C. ايليجانس

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار كيفية تجميع ومحاذاة نظام الاستئصال بالليزر لدراسة تجديد المحاور العصبي في CL gans. يتم تحقيق ذلك عن طريق تركيب غدة ليزر مستقطب طومسون نصف موجة لوحة تحول مرآة ، سكة منظار ومرآة سكة حديد إلى اللوح. الخطوة التالية من الإجراء هي محاذاة شعاع الليزر مع الحزمة الصادرة من عدسة مكثف المجهر.

ثم يتم تركيب عدسة موسع شعاع الليزر ومحاذاة ووضعها لتوسيط شعاع الليزر وجعله متباعدا. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في جعل بقعة الاستئصال بالليزر متطابقة مع تركيز الصورة عن طريق إجراء تعديلات دقيقة. في النهاية ، من الممكن قطع محاور نصف ميكرون بدقة مع الحد الأدنى من تلف الأنسجة الجانبية باستخدام شعاع الليزر المحدود للحيود عندما تكون محاذاة XY NC غير كاملة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل ليزر الفيمتو الثاني ، هي أنها غير مكلفة نسبيا عند 15 ، 000. إنه لا يحتاج إلى صيانة نسبيا ويوفر قطعا دقيقا للغاية للمحور العصبي. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتجديد محور البحر elgan ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل الذباب وفأر الزرد والجهاز العصبي المحيطي والخلايا المختبرية.

في الأساس أي خلية تقع في نطاق 30 إلى 50 ميكرومتر من السطح. ابدأ بالمكونات الموضوعة على اللوح وقم بتثبيتها أسفل عمود منظار الليزر ودعامات السكك الحديدية المرتفعة. يستخدم هذا النظام ليزر من الفئة الثالثة B يمكن أن يضر عينيك بسهولة ، لذا يرجى أخذ السلامة الآمنة بالليزر على محمل الجد.

تحدث إلى شخص ما في قسم الفيزياء المحلي حول كيفية العمل مع أشعة الليزر الحرة بأمان. دائما أثناء عملية المحاذاة ، اضبط الليزر على أقل طاقة. عندما تنظر من خلال العين ، تأكد من إغلاق الليزر ميكانيكيا وإيقاف تشغيل الليزر.

الآن ، ضع المجهر أولا ، وقم بمحاذاة محور السكك الحديدية. ثانيا ، قم بمحاذاة شعاع الضوء المرسل من عدسة مكثف المجهر. ثالثا ، قم بمحاذاة طرفي السكة مع شعاع المكثف باستخدام فتحة أو عدسة قابلة للتعديل مثبتة على السكة.

استخدم مستوى ومقابس مختبر لضبط ارتفاع السكة قبل المتابعة. تأكد من محاذاة طرفي السكة الحديدية. الآن ، تأكد من أن شعاع الليزر يمر عبر الغدة ، ومستقطب طومسون ولوحة منتصف الطريق ، ولا يصطدم بحوافها أثناء دورانها.

ستقوم لوحة منتصف الطريق بضبط قوة الليزر مع تثبيت جميع المكونات على اللوح. قم بتشغيل الليزر ، واضبط تردد النبضة على 100 وضع مستمر وقلل الطاقة إلى الحد الأدنى باستخدام لوحة المنتصف. استخدم ملاحظة ملصقة أو ورقة عدسة لتصور شعاع الليزر.

الآن لإحضار شعاع الليزر من اللوح. اضبط المرايا المثبتة حركيا وقم بإصلاحها بالتسلسل من الليزر لإحضار الشعاع إلى المرآة المثبتة في نهاية السكة المرتفعة. عند الانتهاء ، يجب محاذاة شعاع الليزر تقريبا مع مركز المرايا ، ويجب توجيه المرايا بزاوية 45 درجة تقريبا إلى محور شعاع الليزر قبل محاذاة شعاع الليزر مع شعاع الضوء المرسل للمجهر.

قم بإزالة أو فتح أي مرشحات وفتحات ND في الوحدة الوسيطة. نبدأ الآن الخطوة الأكثر أهمية لإعطاء قطع دقيق للمحاور دون أضرار جانبية مفرطة. سنقوم بمحاذاة الليزر بدقة في المحور x و y و Z بأقل طاقة ليزر لإعطاء أصغر بقعة استئصال.

يمكن رؤية الليزر وأشعة الضوء المرسلة في وقت واحد على الورق. ضع الورقة بالقرب من منفذ المجهر للبدء. ابدأ الآن في محاذاة الليزر باستخدام تعديلات الدورة التدريبية على المرآة أعلى المنظار والمرآة في نهاية السكة

ضع ورقة بين عدسة المكثف المحاذاة والبرج المفتوح للهدف. استمر في استخدام التعديلات الدقيقة على مرآة السكك الحديدية لمحاذاة شعاع الليزر مع مركز شعاع الضوء المرسل الأكبر. الآن ، قم بإصلاح المجهر في مكانه باستخدام المشابك.

يمكن العثور على خطوات إضافية حول تقييم محاذاة الليزر في المخطوطة المكتوبة. يجب تركيب موسعات شعاع الجليل المزدوجة لتوسيع شعاع الليزر 300 ميكرون 33 مرة لملء الفتحة الخلفية للهدف 10 ملم. ابدأ بتركيب العدسات الأربع على الناقلات.

ثم قم بتوصيل العدسات بالسكك الحديدية بحيث تكون جميعها في نفس المحور البصري وتعامد تماما مع شعاع الليزر. قم بتشغيل الليزر واضبطه على الحد الأدنى من الطاقة والوضع المستمر. اضبط محاذاة الشعاع تقريبا من خلال كل عدسة.

استخدم الورق لرؤية الحزمة. الآن قم بإيقاف تشغيل الليزر. ضع مصراع أمان على الليزر وقم بإزالة المجهر من مسار شعاع الليزر.

أعد تشغيل الليزر وتخيله على جدار قريب. استخدم الضبط الدقيق للعدسات لتوسيع الحزمة. ثم اضبط آخر مرآتين مثبتتين حركيا لمحاذاة الشعاع في دائرة من السطوع المنتظم في الموضع المقدر للفتحة الخلفية الموضوعية.

عرض حجم وتوحيد الشعاع على الورق. ثم اضبط الحزمة على تقارب صفري من خلال ملاحظة كيفية تغير حجم الحزمة مع تحريك الورق بعيدا عن العدسة. قم بإيقاف تشغيل الليزر وقم بتشغيل الغالق الميكانيكي.

حرك المجهر مرة أخرى إلى مسار شعاع الليزر باستخدام المشابك الثابتة لتحديد المحاذاة الصحيحة. استبدل المشابك الموجودة على الجانب الحر من المجهر ، لكن لا تشد ربطها. الآن قم بتشغيل الليزر.

قم بإزالة مصراع الأمان وقم بتدوير البرج الموضوعي إلى وضع مفتوح باستخدام الورق على المسرح ويجب أن يكون شعاع الليزر الموسع والموحد المتمركز على شعاع الضوء المرسل من المكثف مرئيا. إذا لم تكن في المنتصف ، فقم بتوسيط الحزم عن طريق فك مشابك المجهر ودفع المجهر بعناية. الآن قم بتشغيل مصراع الأمان واضبط الليزر على وضع التشغيل.

قم بتدوير الهدف 60 مرة في مكانه. الآن صورة خدوش السطح على شريحة مستهدفة. قم بإزالة مصراع الأمان ، وقم بتشغيل ليزر الاستئصال ، واضبط طاقة الليزر للحد الأدنى من نقطة الاستئصال.

يجب أن تكون البقعة دائرية وفي حدود خمسة إلى 10 ميكرون من مركز الصورة والمركز وبقعة الاستئصال. باستخدام التعديلات الدقيقة لمرآة السكك الحديدية المثبتة حركيا للحفاظ على البقعة في المنتصف ومظهر الشعاع موحد ، سيكون من الضروري ضبط المرآة المثبتة على السكك الحديدية ومرآة المنظار العلوية بشكل متكرر. قم بتقييم التركيز Z لليزر عن طريق تحريك التركيز لأعلى ولأسفل بشكل منهجي في خطوات ميكرون واحدة تؤدي إلى تشغيل ليزر الاستئصال في كل خطوة.

إذا تم توسيع الشعاع ومحاذاته بشكل صحيح ومع تقارب تم ضبطه بشكل صحيح ، فيجب أن يستعصي إلى أقصى حد عند تركيز الصورة وضعيفا أو لا يكون على الإطلاق ، ميكرون واحد أعلى أو أقل من التركيز. إذا كانت نقطة الاستئصال القصوى أعلى أو أسفل تركيز الصورة ، فقم بإجراء التعديلات النهائية على التركيز Z للحزمة الموسعة عن طريق تحريك العدسة L ثلاثة من التلسكوب الجليل حتى يتطابق الاستئصال بالليزر مع تركيز الصورة. تم تركيب الديدان الخيطية على شريحة مخصصة وتم استئصال المحاور باستخدام النظام المبني ، وكان التصوير بفاصل زمني لتجديد المحاور العصبي قويا للغاية.

باستخدام مرحلة آلية ، كان من الممكن قص وتصوير خمسة محاور بشكل روتيني ودقيق في خمسة مختلفة. على شريحة واحدة. كان وقت تصوير المحاور هو العامل المحدد.

أنتجت حوالي 10٪ من التجارب أفلاما عالية الجودة بفاصل زمني. قدمت جميع التجارب المتبقية بيانات جيدة ، لكنها كانت أقل جاذبية من الناحية الجمالية بسبب حركات الارتعاش الصغيرة للدودة التي بدأت بشكل عام بعد خمس إلى ثماني ساعات من الشلل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم دائما تقييم محاذاة الليزر بدقة في المحور x و y و Z.

المشكلة الأكثر شيوعا التي يواجهها الأشخاص في محاولة قطع المحور العصبي هي الأضرار الجانبية أو عدم القدرة الكاملة على قطع المحاور ، وهذا دائما ما يرجع إلى الليزر المنحرف. سيسمح لك نظام الاستئصال بالليزر والتقنية لتصور تجديد المحور العصبي في c Agains بفحص تأثير أي طفرة جينية بشكل روتيني على تجديد Axon. NCL مرة أخرى.