التصحيح ، المشبك قياسات السعة والكالسيوم 2 + التصوير في محطات عصب واحد في شرائح الشبكية
January 19th, 2012
نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد آغار جزءا لا يتجزأ من شرائح الشبكية التي هي مناسبة للالكهربية وCA2 التصوير +. هذا الأسلوب يسمح احد لدراسة الشريط من نوع المشابك في شبكية العين باستخدام رقائق مباشرة التصحيح ، المشبك تسجيلات احد المحطات العصبية قبل المشبكي.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد شرائح شبكية أجار مدمجة لدراسة الدوائر الدقيقة الموجودة في الأطراف العصبية للخلايا ثنائية القطب قبل المشبكي. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحصول أولا على شبكية العين من عين سمكة ذهبية داكنة متكيفة وقطع قطعة صغيرة مستطيلة من شبكية العين. ثم يتم غمر قطعة الشبكية في محلول أجار شفاف ومنخفض نقطة الانصهار ، والذي يتم تجميده بعد ذلك في محلول شريحة باردة لطيف.
الخطوة التالية هي تقطيع كتلة الأجار الصلبة التي تحتوي على قطعة مستطيلة من شبكية العين باستخدام هزاز. الخطوة الأخيرة هي التصور والتحديد والتصحيح. المشبك محطة عصبية الخلية ثنائية القطب.
في النهاية ، تظهر النتائج تيار الكالسيوم قبل التشابك وإفراز الخلايا الفيزيائية المشبكية مع قياسات سعة الغشاء من أطراف الخلايا ثنائية القطب المتناثرة والسليمة. مرحبا ، اسمي هان كيم. أنا باحث ما بعد الدكتوراه في PCO في مختبر معهد برهام.
سأقدم اليوم إعداد شريحة AGA المضمنة لشبكية الوجه الباردة وأظهر قياس سعة مشبك التصحيح في خط أنابيب واحد. لبدء هذا الإجراء ، قم بتقطيع كل عين من سمكة ذهبية عن طريق القطع بالتساوي حول مقدمة العين باستخدام مقص زنبركي. ثم ضع أكواب العين في محلول شرائح مبرد بدون كالسيوم.
إذا لزم الأمر ، قم بإزالة العدسة باستخدام الملقط. بعد ذلك ، قم بإزالة ظهارة الصبغة المرتبطة بالشبكية عن طريق تقشير شبكية العين بعيدا عن كوب العين باستخدام ملقط رفيع بزاوية 45 درجة. بعد ذلك ، قم بقص العصب البصري إما بزوج من الملقط الناعم أو مقص زنبركي.
ثم ضع الشفط باستخدام ماصة المعكرونة المعدلة أو ماصة نقل الأطراف الكبيرة. لإزالة شبكية العين ، قم بإزالة باقي ظهارة الصباغ المرتبطة بشبكية العين برفق. يجب أن يبدو سطح شبكية العين النظيفة والصحية ناعما.
ثم عالج شبكية العين المعزولة بحوالي 0.03٪ IDE أعلى لمدة 15 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لإزالة الفكاهة الزجاجية ، لاحظ أنه يجب تنفيذ الإجراء في الإضاءة المنخفضة. في الخطوة التالية ، قم بقص قطعة مستطيلة من شبكية العين حوالي ملليمترين في ملليمترين ، والتي تحتوي على السماكة الكاملة لشبكية العين عن طريق إزالة الحواف المنحنية بشفرة حلاقة.
ثم انقل قطعة الشبكية إلى وعاء صغير مملوء بمحلول أجار وحاول تقليل كمية المحلول حول شبكية العين عند وضعها في أجار السائل. بعد ذلك ، اغمر شبكية العين مع الأجار مباشرة في محلول الشريحة الباردة المثلجة من أجل ترسيخ الأجار. بعد ذلك ، قم بقص كتلة الأجار الصلبة التي تحتوي على قطعة مستطيلة من شبكية العين إلى مكعب واحد تلو الآخر سنتيمتر.
ألصق الكتلة على سطح لوحة التقطيع في حجرة الشريحة الجاهزة. ثم قم بتقطيع الكتلة إلى شرائح بسمك 200 إلى 250 ميكرون في محلول الشريحة المثلجة. باستخدام الاهتزاز ، يمكن الحصول على ما مجموعه خمس إلى 10 شرائح ، وهي قابلة للحياة لمدة خمس إلى ست ساعات.
بعد ذلك ، انقل إحدى الشرائح إلى غرفة التسجيل. ضع إطارا من البلاتين على شكل حرف U مع شبكة من خيوط النايلون أعلى الشريحة. قم بدمج الشريحة بشكل مستمر بمعدل واحد إلى ملليلترين في الدقيقة مع محلول التسجيل المليء بالكربوجين.
في هذه الخطوة، استخدم حقنة برأس مرشح 0.2 ميكرون لملء ماصة الرقعة الزجاجية بمحلول داخلي إلى مستوى واحد إلى سنتيمترين من الجزء الخلفي من الماصة. ثم قم بإزالة فقاعات الهواء من الحافة بعد ذلك. قم بتأمين الماصة في الحامل.
قم بالضغط الإيجابي على الماصة وحركها نحو الطرف المستهدف باستخدام مناور دقيق أثناء تحريك الطرف لأسفل عبر الشريحة. حرك الماصة في اتجاه كنس جانبي لضمان عدم سحب الشريحة مع الطرف. ثم حرك طرف الماصة حول الطرف لتنظيف سطح الغشاء.
ادفع الطرف لأسفل مقابل حافة الطرف لإنشاء غمازة وتحرير الضغط الإيجابي. إذا لم يتم تشكيل ختم جيجا أوم ، فقم على الفور بالضغط السلبي الطفيف على الماصة. بمجرد تشكيل ختم جيجا أوم ، قم بتبديل مضخم مشبك التصحيح E PC إلى وضع التسجيل عند البيع وقم بتغيير إمكانات الاحتفاظ إلى 60 تحت الصفر أو 70 مللي فولت تحت الصفر.
قم بتطبيق تصحيح السعة السريع وانتظر حتى يستقر الختم بين خمسة إلى 10 جيجا أوم. ثم تمزق الغشاء بشفط حاد ولطيف. لإنشاء تكوين تسجيل الخلية بالكامل.
يمكنك أيضا استخدام شفط الفم بدلا من المحقنة. بعد إنشاء تكوين الخلية بالكامل على طرف MB متفتت ، قم بتطبيق إزالة الاستقطاب بخطوة 200 مللي ثانية من سالب 70 إلى صفر مللي فولت. تذكر أن موجة جيبية بحجم كيلوهرتز في وضع مشبك الجهد يتم تطبيقها قبل وبعد إزالة الاستقطاب من أجل قياس سعة الغشاء ، يسمح إزالة الاستقطاب بالقياس المباشر لتيارات الكالسيوم الداخلية التي يتم تنشيطها عن طريق فتح قنوات الكالسيوم من النوع L ذات الجهد الكهربائي مع محلول داخلي قائم على السيزيوم.
في موازاة ذلك ، يمكن للمرء مراقبة قفزة السعة الناتجة عن إفراز الخلايا المعتمد على الكالسيوم للحويصلات المشبكية ، مما يزيد من مساحة سطح الغشاء. إذا تم ترقيع خلية ثنائية القطب MB سليمة بالماصة الموجودة على الطرف المشبكي ، فلن يتم ملاحظة تيارات الكالسيوم الملحوظة بسبب تيارات التسرب الكبيرة بسبب اقتران تقاطع الفجوة في حقوق فعل الخلايا ثنائية القطب MB. ما يلاحظه المرء هو تسرب خارجي كبير مثل التيار.
ومع ذلك ، لا يزال المرء قادرا على مراقبة قفزة السعة باستخدام حافز جيبي عالي التردد يتم تنشيطه قبل وبعد خطوة إزالة الاستقطاب الموضحة. فيما يلي أمثلة على صور I-R-D-I-C لأطراف الخلايا ثنائية القطب M. من المرجح أن تظهر الأطراف السليمة بيضاوية الشكل كما هو موضح في A و B بينما تظهر C الطرف الصغير ، والذي يبدو مستديرا ودائريا.
يمكن أيضا استخدام طريقة تعبئة الصبغة لتصنيف أطراف الخلايا. فيما يلي أمثلة على الصور المضان لأطراف الخلايا ثنائية القطب MBI مع محور عصبي سليم في D ، ومحور عصبي مقطوع جزئيا في e ومحور عصبي تمت إزالته بالكامل في F ، ويشار إلى teria الخاصة بهم بواسطة الأسهم الزرقاء. يوضح هنا القياسات المباشرة لإشارات تصوير الكالسيوم وإفراز الخلايا وردود الفعل المثبطة.
في محطة الخلية ثنائية القطب MB ، تم تنشيط تركيز الكالسيوم المرتفع العابر في teleria لمحطة MB عن طريق إزالة الاستقطاب بخطوة مشبك الجهد في صورة التألق المقابلة ل MB teleria يمكن رؤيتها في B. تظهر أمثلة على الاكتئاب المشبكي قصير المدى لإطلاق الناقل العصبي في C. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقليل كمية المحلول حول شبكية العين عند وضعه في مجموعة أجار. سيؤدي ذلك إلى تحسين تعلق اللاتينية من كتلة أجار.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تصف هذه المقالة بروتوكولًا لإعداد شرائح شبكية مضمنة في الآغار مناسبة لدراسة الدوائر الدقيقة في الأطراف العصبية الخلالية ثنائية القطب ما قبل المشبكية. تُمكّن الطريقة من تسجيلات توصيل مباشر منفردة للأطراف العصبية ما قبل المشبكية، مما يسهل التحقيق في المشابك من نوع الشريط في الدوائر الشبكية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزيولوجيا الكهربائية
- تقنيات التصوير
الخلفية
- تلعب الدوائر الدقيقة للشبكية دورًا حاسمًا في معالجة الرؤية.
- فهم الآليات التشابكية ضروري لأبحاث علم الأعصاب.
- توفر تضمين الآغار دعمًا هيكليًا للشرائح الرقيقة.
- تسمح تقنيات التوصيل المباشر بالقياسات الكهربائية الدقيقة.
غرض الدراسة
- إعداد شرائح شبكية للتحليل الكهربائي الفسيولوجي.
- دراسة وظيفة المشابك من نوع الشريط.
- تعزيز فهم ديناميات الدوائر الدقيقة للشبكية.
الطرق المستخدمة
- الحصول على الشبكية من عيون أسماك الزينة المكيفة على الظلام.
- تضمين قطع الشبكية في آغار ذو نقطة انصهار منخفضة.
- تقطيع كتلة الآغار الصلبة باستخدام جهاز الذبذب.
- تصور وتوصيل مباشر للأطراف العصبية الخلالية ثنائية القطب.
النتائج الرئيسية
- التحضير الناجح للشرائح الشبكية المضمنة في الآغار.
- تم إثبات جدوى تسجيلات التوصيل المباشر.
- تحديد المشابك من نوع الشريط في الدوائر الشبكية.
- تسمح الطريقة بدراسة مفصلة للوظيفة التشابكية.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة الدوائر الدقيقة للشبكية.
- يمكن أن تكشف تسجيلات التوصيل المباشر عن الديناميات التشابكية.
- قد يتقدم هذا النهج البحث في علم الأعصاب البصري.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct electrophysiological and optical interrogation of presynaptic nerve terminals in retinal microcircuits, supporting mechanistic de-risking of synaptic targets involved in visual signal processing. By quantifying calcium-dependent exocytosis and inhibitory feedback at ribbon-type synapses, it provides predictive confidence in target validation for neuroscience discovery programs. The approach addresses a key inflection point in early discovery where functional validation of presynaptic mechanisms informs go/no-go decisions for modulator development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring presynaptic calcium currents and capacitance changes linked to vesicle exocytosis.
- Operational Value: Enables biological de-risking of ribbon-type synapse function through direct access to isolated nerve terminals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying short-term plasticity of excitatory and inhibitory neurotransmitter release.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by stabilizing retinal slices for electrophysiology and imaging.
- Quantitative Outputs: Generates reproducible membrane capacitance and calcium imaging readouts enabling compound effect comparison.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple terminals per slice, enhancing throughput for synaptic mechanism interrogation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with retinal neurodegenerative disease models where synaptic dysfunction precedes cell loss.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by preserving native microcircuit architecture in agar-embedded slices.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on modulator efficacy by capturing reciprocal feedback inhibition dynamics from amacrine cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing functional readouts of presynaptic activity in a disease-relevant system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of presynaptic mechanisms via direct measurement of calcium influx and exocytosis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slice preparation and stable terminal access for repeated recordings.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions using membrane capacitance jumps and calcium imaging as dependent variables.
- Translational Research: Maintains preclinical continuity by preserving synaptic microcircuits in retinal slices for longitudinal study.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for probing synaptic function across multiple experimental sessions per preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in presynaptic signaling.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized agar embedding and slicing procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering quantitative data on synaptic plasticity and feedback inhibition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds modulating presynaptic calcium channels or vesicle release machinery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in patch-clamp electrophysiology and calcium imaging techniques.
- Depends on vibratory slicing equipment and low-melting-point agar for tissue stabilization.
- Necessitates cross-team standardization for consistent slice quality and terminal identification.
- Involves adaptation considerations when transferring to other model systems with different synaptic architectures.
- Limited by tissue viability window of 5–6 hours post-slicing, requiring same-day experimental execution.
