الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير شرائح عضوية من الدماغ المتوسط الجنيني في اليوم E 12.5 لتحليل العصبونات الدوبامينية النامية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح الدماغ الجنيني، ثم يتم غمر الدماغ في مادة الأغار منخفضة درجة الانصهار.

تتمثل الخطوة الثالثة في تقطيع شرائح الدماغ باستخدام جهاز القطع الاهتزازي (vibratome). أما الخطوة النهائية فهي اختيار شريحة الدماغ المناسبة للاستنبات والتصوير بالفاصل الزمني. وفي الختام، يُستخدم التصوير بالفاصل الزمني والمجهر الفلوري المناعي لإظهار الخطوات المبكرة للخلايا العصبية الدوبامينية، وسلوك الهجرة، والتمايز.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التطور العصبي، مثل تتبع سلوك الخلايا العصبية والهجرة خلال تطور الجزء البطني من الدماغ. قبل يوم واحد من عملية التشريح، قم بتحضير محلول Krebs buffer ووسط الزرع وفقاً للمخطوطة المرفقة قبل التشريح بحوالي ساعتين. قم بتحضير 100 milliliters من 4% low melting agarose في محلول Krebs buffer عن طريق تسخين المحلول في الميكروويف حتى يذوب agarose تماماً.

بعد ذلك، ضع الحلقات (aros) في حمام مائي بدرجة حرارة 45 °C. ثم، املأ صينية محلول Vibram المنظم بمحلول Krebs المنظم والمبرد بالثلج. قم بتشغيل عنصر التبريد وحافظ على درجة الحرارة عند 4 °C.

بعد ذلك، قم بتثبيت شفرة حلاقة في حامل الشفرات. جهز مشرطاً، وفرشاة رسم دقيقة، وملعقة مثقبة صغيرة لالتقاط الشرائح من منطقة الهزاز من أجل التقطيع لاحقاً. ثم أضف محلول Krebs المنظم إلى أطباق بتري المعقمة واحفظها على الثلج.

في منطقة التشريح، قم بتجهيز ثلاثة أطباق بتري معقمة كبيرة للتشريح وطبقين بتري معقمين صغيرين لوضع الأدوات، ومقص صغير، وملقطين دقيقين، وملعقة مثقبة صغيرة، وماصة باستير زجاجية مصقولة بالنار ذات طرف دائري مغلق، ولتر واحد من محلول كريبس المنظم (Krebs buffer) على الثلج. امسح جميع أدوات التشريح باستخدام الإيثانول بتركيز 70%. بعد ذلك، أضف الوسط الزرعي إلى آبار طبق يحتوي على ستة آبار، ثم قم بتحضينه عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعتين.

بعد ذلك، أضف 1.5 milliliters من محلول Krebs المنظم مع penicillin streptomycin إلى كل بئر في لوحة أخرى ذات ستة آبار تحت ظروف معقمة. ضع أغشية milli cell membrane الإدخالية في الآبار. ضع اللوحة ذات الستة آبار بجانب جهاز vibrato بحيث يمكن نقل شرائح الدماغ إلى أغشية الترشيح.

مباشرة بعد عملية التقطيع، يتم التضحية بأنثى فأر حامل تكون أجنّتها في المرحلة E 12.5 وإزالة الرحم عن طريق رفعه باستخدام ملقط. ثم استخدم ملقطاً آخر لفصل عضلة الرحم عن الرحم. بعد ذلك، ضع الرحم في محلول Krebs المنظم المبرد بالثلج تحت المجهر.

استخدم زوجاً من الملاقط الدقيقة لفصل الجدار العضلي للرحم، وغشاء ريكر (riker's membrane)، وكيس المح الكيس الحشوي عن الجنين. بعد ذلك، أخرج الأجنة من الرحم وانقل الجنين إلى طبق بتري منفصل يحتوي على محلول "كريبس" المنظم المعقم. تالياً، قم بقطع رأس كل جنين من الأجنة.

ثبّت الرأس عن طريق ثقبه عند مستوى العين باستخدام ملقط دقيق. استخدم زوجاً آخر من الملاقط لإزالة الجلد والجمجمة بعناية. بعد ذلك، ارفع الدماغ بحذر وانقله إلى أطباق بتري تحتوي على محلول منظم Krebs المعقم.

بعد ذلك، اغسل الأدمغة في 4%Low melting point aros. قم بتضمين دماغين إلى ثلاثة أدمغة في كل مرة في 4%fresh, low melting point aros. باستخدام ماصة باستور ذات طرف مستدير مصقول بالنار.

بعد ذلك، ضع أطباق التضمين على الثلج بشكل متساوٍ قدر الإمكان. ثم، ارفع الأدمغة حتى يتصلب الجزء السفلي من قالب الـ aros، لكي تستقر الأدمغة بشكل متساوٍ وتكون موازية لقاع كتلة الـ aros. وعندما يتصلب الـ aros تماماً، قم بتشذيب الـ aros المحيط بالأدمغة.

بعد ذلك، قم بلصق القالب على منصة العينات في جهاز التقطيع الاهتزازي. عند لصق القالب، تأكد من أن الجانب البطني للدماغ موازٍ للمنصة. قم بتقطيع شرائح أفقية بسمك 300 micron وبتردد 50 hertz وسعة شفرة تبلغ 1.1 millimeters وبسرعة 25 millimeters per second.

اجمع شرائح الدماغ باستخدام فرشاة رسم دقيقة لدفع الشريحة إلى ملعقة مثقبة صغيرة. ثم انقلها إلى طبق يحتوي على محلول Krebs المنظم المعقم والمبرد بالثلج تحت المجهر. اختر الشريحة التي تحتوي على أنسجة الدماغ المتوسط البطنية.

في هذه الخطوة، استخدم ملعقة صغيرة مثقبة وفرشاة رسم دقيقة لنقل شرائح الدماغ إلى غشاء ترشيح (inserts) في طبق سداسي الفجوات يحتوي على محلول Krebs المنظم الذي تم تحضيره مسبقاً. بعد ذلك، انقل الأغشية التي تحمل الشرائح إلى طبق سداسي الفجوات آخر يحتوي على وسط استزراع، مع الحفاظ على الجزء العلوي من الأغشية جافاً لضمان حصول شرائح الدماغ على الوسط من الأسفل والهواء من الأعلى.

ضع الشرائح في حضانة تحتوي على 5% ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. من المهم جداً وضع الشرائح في الحضانة خلال ساعتين من الخطوة الأولى من عملية التشريح. يمكن الحفاظ على هذه الشرائح في المختبر (in vitro) لمدة تتراوح من ثلاثة إلى أربعة أيام.

بعد أربع إلى خمس ساعات من التعافي، يمكن استخدام الشرائح في التصوير بالفاصل الزمني مباشرة قبل البدء بالتصوير. أضف 1.5 µL من حمض الأسكوربيك بتركيز 200 mM إلى الطبق لحماية الشرائح من السمية الضوئية.

قم بتحضين الشرائح في غرفة بيئية عند 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون أثناء التصوير بفاصل زمني. تظهر هنا شريحة حادة توضح الموقع الطبيعي للعصبونات الدوبامينية في الدماغ المتوسط البطني، والتي لم تكن الإسقاطات إلى الدماغ الأمامي قد تطورت فيها بعد. وبعد يوم واحد في المزرعة، تبدأ الإسقاطات إلى الدماغ الأمامي في التكون كما يشير السهم الأصفر.

تشير رؤوس السهام البيضاء إلى موقع أجسام الخلايا الموضحة بتكبير أعلى في الصور المدرجة. هنا يظهر الجذر الهجري للعصبونات المصبوغة بـ YFP. وفي شريحة أفقية حادة، تم تحديد الموضع الأولي للخلايا برأس سهم أحمر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير شرائح نمطية جينية من الدماغ المتوسط للجنين البحري في المرحلة E 12.5 للحصول على شرائح قابلة للحياة وسليمة. من المهم إجراء تشريح دماغ الجنين بعناية، واختيار شريحة الدماغ الصحيحة للاستزراع والتصوير بفاصل زمني (TimeLapse) بعد التقطيع بجهاز الفايبراتوم (vibrato sectioning).