الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد شرائح عضوية من الدماغ المتوسط الجنيني للخلايا العصبية E 12.5 لتحليل الخلايا العصبية الدوبامينية النامية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الدماغ الجنيني أولا. ثم يتم تضمين الدماغ في الانقسام المنخفض الذوبان.

الخطوة الثالثة هي تقسيم شرائح الدماغ باستخدام هزاز. الخطوة الأخيرة هي اختيار شريحة الدماغ المناسبة للثقافة والتصوير بفاصل زمني. في النهاية ، يتم استخدام التصوير بفاصل زمني والفحص المجهري المناعي لإظهار الخطوات المبكرة للخلايا العصبية الدوبامينية والسلوك المهاجر والتمايز.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال النمو العصبي ، مثل متابعة الخلايا العصبية والسلوكيات المهاجرة أثناء نمو الدماغ البطني. قبل يوم واحد من التشريح ، قم بإعداد مخزن X Krebs المؤقت ووسط الثقافة وفقا للمخطوطة المصاحبة قبل حوالي ساعتين من التشريح. قم بإعداد 100 مل من 4٪ من الصائب المنخفض في مخزن Krebs المؤقت عن طريق طهي المحلول في الميكروويف حتى يذوب aros تماما.

ثم ضع الحروس في حمام مائي 45 درجة مئوية. بعد ذلك ، املأ صينية Vibram العازلة بمحلول Krebs المثلج البارد. قم بتشغيل عنصر التبريد واحتفظ به عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، قم بإصلاح شفرة الحلاقة في حامل الشفرة. قم بإعداد مشرط وفرشاة رسم ناعمة وملعقة صغيرة مثقبة لالتقاط الشرائح في منطقة الهزاز لتقسيمها لاحقا. ثم أضف مخزن كريبس إلى أطباق بتري المعقمة واحتفظ بها على الجليد.

في منطقة التشريح ، قم بإعداد ثلاثة أطباق بتري كبيرة معقمة للتشريح وطبقين صغيرين معقمين من بتري لتضمين زوج من المقص الصغير ، وزوجين من الملقط الناعم ، وملعقة صغيرة مثقبة ، ونار ماصة مرعى زجاجية مصقولة بطرف مغلق دائري ولتر واحد من عازلة كريبس على الجليد. امسح جميع أدوات التشريح بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، أضف وسط الاستزراع إلى آبار صفيحة ستة آبار واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.

بعد ذلك ، أضف 1.5 مل من عازلة كريبس مع ستربتومايسين البنسلين إلى كل بئر من ستة ألواح أخرى في ظل ظروف معقمة. ضع إدراج غشاء الخلية الملي في الآبار. ضع لوحة الآبار الستة بجوار الاهتزاز بحيث يمكن نقل شرائح الدماغ إلى أغشية المرشح.

مباشرة بعد التقطيع ، ضحي بأنثى فأر حامل مع أجنة في المرحلة E 12.5 وقم بإزالة الرحم عن طريق رفعه بزوج من الملقط. ثم استخدم زوجا آخر من الملقط لتمزيق عضل الرحم بعيدا عن الرحم. بعد ذلك ، ضع الرحم في عازلة كريبس الباردة المثلجة تحت المجهر.

استخدم زوجا من الملقط الناعم لفصل الجدار العضلي للرحم وغشاء الريكر وكيس صفار الحشوية عن الجنين. ثم قم بإزالة الأجنة من الرحم وانقل الجنين إلى طبق بتري منفصل مع عازلة كريبس معقمة. بعد ذلك ، قم بقطع رأس كل جنة.

ثبت الرأس عن طريق ثقبه على مستوى العين باستخدام زوج من الملقط الناعم. استخدم زوجا آخر من الملقط لإزالة الجلد والجمجمة بعناية. ثم ارفع الدماغ بعناية وانقله إلى طبق بتري مع عازلة كريبس المعقمة.

بعد ذلك ، اغسل الأدمغة في 4٪ نقطة انصهار منخفضة. قم بتضمين أدمغتين إلى ثلاثة أدمغة في وقت واحد في 4٪ من نقطة الانصهار المنخفضة الطازجة. باستخدام ماصة باستور ذات طرف دائري مصقول بالنار.

ثم ضع أطباق التضمين على الجليد قدر الإمكان. بعد ذلك ، ارفع الأدمغة حتى يتم ترسيخ الجزء السفلي من الأدمغة ، بحيث يمكن للأدمغة أن تستقر بالتساوي وتكون موازية لأسفل كتلة الحروس. عندما يتجمد العروف تماما ، قم بقص الأدمغة المحيطة.

بعد ذلك الغراء ، يتم حظر aros على مرحلة العينة من الهزاز. عند لصق الكتلة ، تأكد من أن الجانب البطني من الدماغ مواز للمنصة. شريحة أفقية بسمك 300 ميكرون بتردد 50 هرتز سعة شفرة 1.1 ملم وسرعة 25 ملم في الثانية.

اجمع شرائح الدماغ باستخدام فرشاة الرسم الدقيقة لدفع الشريحة إلى ملعقة صغيرة مثقبة. ثم انقلها إلى طبق به عازلة كريبس مثلجة معقمة تحت المجهر. اختر الشريحة التي تحتوي على أنسجة الدماغ المتوسط البطني.

في هذه الخطوة ، استخدم ملعقة صغيرة مثقبة وفرشاة رسم دقيقة لنقل شرائح الدماغ إلى إدخالات غشاء خلية ملي في صفيحة من ستة آبار مع عازلة كريبس التي تم تحضيرها مسبقا. بعد ذلك ، انقل الأغشية مع الشرائح إلى ستة أخرى. لوحة جيدة مع وسط ثقافة ، حافظ على الجزء العلوي من الأغشية جافة بحيث تتلقى شرائح الدماغ وسطا من الأسفل والهواء من الأعلى.

ضع الشرائح في حاضنة بها 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. من المهم جدا وضع الشرائح في الحاضنة في غضون ساعتين بعد الخطوة الأولى للتشريح. يمكن الحفاظ على هذه الشرائح في المختبر لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام.

بعد أربع إلى خمس ساعات من الشفاء. يمكن استخدام الشرائح في التصوير بفاصل زمني قبل التصوير مباشرة. أضف 1.5 ميكرولتر ، 200 مللي مولار من حمض الأسكوربيك إلى الطبق لحماية الشرائح من السمية الضوئية.

احتضان الشرائح في غرفة بيئية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون أثناء التصوير بفاصل زمني. فيما يلي شريحة حادة توضح الموقع الطبيعي للخلايا العصبية الدوبامين في الدماغ الأوسط البطني حيث لم تتطور الإسقاطات على الدماغ الأمامي بعد. بعد يوم واحد في الثقافة ، تبدأ الإسقاطات على الأدمغة الأمامية في التكون كما هو موضح في السهم الأصفر.

يشير رأس السهم الأبيض إلى موقع أجسام الخلايا الموضحة بتكبير أعلى في المجموعات. فيما يلي الجذر المهاجر للخلايا العصبية المسماة YFP. في شريحة أفقية حادة ، يتم تمييز الموضع الأولي للخلايا برأس سهم أحمر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير شرائح النمط الجيني من الدماغ المتوسط الجنيني البحري E 12.5 للحصول على شرائح قابلة للحياة وسليمة. من المهم إجراء تشريح الدماغ الجنيني بعناية وبعد التقسيم الاهتزازي لاختيار شريحة الدماغ الصحيحة للزراعة والتصوير بفاصل زمني.