الإنتاج والكشف عن أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) في السرطان
November 21st, 2011
هنا نقترح طرق بسيطة لاختبار وتقييم وجود أنواع الاكسجين التفاعلية في الخلايا.
الهدف من هذه التجربة هو الكشف عن وجود أنواع الأكسجين التفاعلية في مزارع الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق الكشف أولا عن أنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام صبغة الفلورسنت. بعد ذلك ، يتم قياس مستويات أكسيد النيتريك في الخلايا باستخدام مقايسة الألوان.
أخيرا ، يتم تحديد تأثير أنواع الأكسجين التفاعلية عن طريق الكشف عن تقليل أو أكسدة الجلوتاثيون باستخدام مقايسة المضيء. اسمي دانو. أنا ملصق في مختبر باتريزيا يودا ، وسأعرض هذا الإجراء.
Carboxy H 2D CFDA غير فلوري ، ولكن في وجود أنواع الأكسجين التفاعلية ، يتأكسد هذا الكاشف ويتألق اللون الأخضر قبل الاستخدام مباشرة. قم بإعداد محلول مخزون طازج من الكربوكسي H 2D CFDA في DMSO معقم أو 100٪ إيثانول. اغسل الخلايا بمحلول ملح مخزن ب HEPs أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات لإزالة آثار الوسط الأصلي.
في هذا الاختبار ، نستخدم خط خلايا القط البشري سرطان الدم. بعد الطرد المركزي ، تخلص من SUP natant ، قم بتحميل الخلايا بالصبغة كتركيز نهائي من ميكرومولار واحد في وسط مزرعة منتظم مع مخفضة مصل ، احتضان الثقافات لمدة 30 دقيقة في الظلام في حاضنة تقليدية ، وتخلص من أي محلول صبغة غير مستخدم. بعد ذلك ، قم بإزالة وسيط Carbox CH 2D CFDA المحتوي على وغسل الخلايا مرتين باستخدام HBSS أو PBS.
انقل الخلايا إلى لوحة ومن هذه الخطوة إلى الأمام ، قم بحماية الخلايا من الضوء. ثم أضف وسيطا جديدا يحتوي على دواء مفضل إلى الخلايا المحملة بالكربوكسي H 2D CFDA والحاضنات المطلوبة. في هذا المثال، نستخدم بيروكسيد الهيدروجين 0.03٪ لمدة ساعة واحدة.
تشمل خلايا التحكم الخلايا غير المعالجة التي تم تنزيلها والخلايا غير المعالجة غير الملوثة. قم بتقييم ROS على الفور عن طريق تحليل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي. باستخدام قناة FL واحدة ، باستخدام قارئ لوحة مضان أو عن طريق المجهر الفلوري باستخدام الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث المناسبة للتألق الأخضر.
قبل البدء في هذا الاختبار ، قم بإعداد الحلول التالية. محلول 0.1٪ من ثنائي هيدروكلوريد الإيثيلين أو NED المخفف في ماء معقم. محلول 1٪ من أميد السلفوريل مخفف في 5٪ حمض الفوسفوريك ، وتخفيف تسلسلي لنتريت الصوديوم في وسط معقم ، بدءا من محلول مخزون قياسي 0.1 مولار يخزن NED و Sulfuryl Aide Solutions في ظلام خلايا مزرعة أربع درجات مئوية في صفيحة بئر 96 باستخدام ثلاث نسخ لكل حالة وضوابط مناسبة.
في هذه التجربة للحث على إنتاج أكسيد النيتريك ، يتم معالجة خلايا البلاعم الفأرية الخام 2 6 4 0.7 ب 100 نانوغرام لكل ملليلتر من عديد السكاريد LIPA أو LPS والمؤتلف IL أربعة. لإجراء الفحص ، قم بإحضار كلا الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة ، وقم بتدوير اللوحة ، وجمع المواد الطافية للخلية ، ونقل 50 ميكرولترا إلى لوحة جديدة 96 بئر. ثم قم بإعداد آبار التخفيف المحددة لمحلول المخزون القياسي.
لعمل منحنى قياسي ، أضف 50 ميكرولترا من محلول الكبريت IDE إلى كل عينة وتحكم جيدا واخلطه جيدا. احتضن درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في الظلام. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من محلول NED إلى كل عينة وتحكم جيدا واخلطها.
حسنا ، احتضن اللوحة في الظلام لمدة 10 دقائق إضافية باستخدام مقايسة الشحوم ، هناك تغيير سريع في خياطة أنواع الأكسجين النشطة. لذلك ، من المهم العمل بسرعة لمنع فقدان الإشارة الأولية. قم بقياس الامتصاص على الفور باستخدام قارئ لوحة بأطوال موجية للمرشح تتراوح بين 520 نانومتر و 550 نانومتر ، وسيظهر اللون البنفسجي في الآبار الموجبة.
قارن النتائج بالمعيار للتحقق من استقرار المحاليل في اليوم السابق لخلايا بذور الفحص في صفيحة بيضاء 96 جيدا في ثلاث نسخ لكل حالة في اليوم التالي ، وعلاج الخلايا بالدواء المفضل للوقت المطلوب. في هذا المثال ، تتم معالجة jca و 5 49 خلية لمدة ساعة واحدة بخمسة مللي مولار و 2.5 مللي مولار بيروكسيد الهيدروجين على التوالي. يتم معالجة الخلايا الخام 2 6 4 0.7 ب 200 نانوجرام لكل مليلتر من LPS لمدة 16 ساعة.
قم بإزالة الوسط من الآبار ذات الخلايا اللاصقة. لا تقم بإزالة الوسيط إذا كانت الخلايا معلقة. لا يزيد عن 30 دقيقة قبل إجراء الفحص.
تحضير كواشف تحلل الجلوتاثيون المختزلة والمؤكسدة. أضف الكواشف إلى الآبار المرغوبة ورتجها لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، أضف كاشف توليد اللوسيفيريان واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ثم أضف كاشف الكشف عن اللوسيفيريان واحتضنه لمدة 15 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، اقرأ إشارة التلألؤ البيولوجي في مؤقت التكامل. 0.25 إلى ثانية واحدة لكل بئر باستخدام لوحة ، اقرأ مقياس الإضاءة هنا.
تتممقارنة الخلايا المعالجة ببيروكسيد الهيدروجين بالخلايا غير المعالجة. تحفز أنواع الأكسجين التفاعلية تعديل الكربوكسي H 2D CFDA الذي يتألق باللون الأخضر كما تكتشف الحقائق. تؤكد النتائج وجود أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا المعالجة.
في هذا المثال ، تم التعامل مع الخلايا الخام 2 6 4 0.7 باستخدام LPS و IL أربعة. تم الكشف عن زيادة كبيرة في إنتاج أكسيد النيتريك في الخلايا المعالجة مقارنة بالخلايا الضابطة غير المعالجة. هنا ، تم معالجة الخلايا الخام 2 64 0.7 باستخدام LPS و jca ، و 5 49 خلية تمت معالجتها ببيروكسيد الهيدروجين.
يتم التعبير عن النتائج على أنها نسبة الجلوتاثيون المختزل إلى المؤكسد. تم الكشف عن نسب أقل للجلوتاثيون في الخلايا المعالجة مقارنة بالخلايا الضابطة غير المعالجة مما يشير إلى أن البروتينات كانت أكثر أكسدة في الخلايا غير المعالجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف الخام باستخدام هذه المقايسات.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طرقًا لاكتشاف أنواع الأكسجين التفاعلية في مزارع الخلايا. تشمل التقنيات استخدام الأصباغ الفلورية، والاختبارات الملونة، والاختبارات المضيئة لتقييم الإجهاد التأكسدي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- الكيمياء الحيوية
- بحث الإجهاد التأكسدي
الخلفية
- تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) دورًا حاسمًا في الإشارات الخلوية.
- يمكن أن يؤدي الإفراط في ROS إلى تلف الخلايا والمرض.
- اكتشاف ROS ضروري لفهم العمليات البيولوجية المختلفة.
- الاختبارات الفلورية والملونة هي طرق شائعة لاكتشاف ROS.
غرض الدراسة
- لتطوير طرق بسيطة لتقييم وجود ROS في الخلايا.
- لقياس مستويات أكسيد النيتريك كمؤشر للإجهاد التأكسدي.
- لتقييم تأثير ROS على مستويات الجلوتاثيون.
الطرق المستخدمة
- اكتشاف أنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام صبغة فلورية.
- قياس مستويات أكسيد النيتريك من خلال اختبار ملون.
- تقييم تقليل أو أكسدة الجلوتاثيون باستخدام اختبار مضيء.
- توضيح الإجراء من قبل أحد أعضاء المختبر.
النتائج الرئيسية
- اكتشاف ناجح لـ ROS في مزارع الخلايا.
- تحدد مستويات أكسيد النيتريك التي ترتبط بالإجهاد التأكسدي.
- تقييم حالة الجلوتاثيون التي تشير إلى حالة الأكسدة والاختزال الخلوية.
- يمكن تكرار الطرق الموضحة بسهولة في إعدادات البحث.
الاستنتاجات
- الطرق المقترحة فعالة في تقييم الإجهاد التأكسدي في الخلايا.
- يمكن أن تساعد هذه التقنيات في فهم دور ROS في الأمراض المختلفة.
- يمكن للبحوث الإضافية التوسع في هذه الأساليب لتطبيقات أوسع.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantitative detection of reactive oxygen species (ROS) and related oxidative stress markers is critical for de-risking early oncology targets and clarifying mechanistic hypotheses in cancer research. Reliable ROS and nitric oxide assays enable translational teams to assess cellular redox states, supporting predictive confidence in disease-relevant models. These validated detection workflows underpin robust target validation and inform risk-adjusted portfolio decisions in oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of oxidative stress pathways implicated in cancer cell signaling.
- Supports functional validation of redox-sensitive targets through quantitative ROS and nitric oxide measurement.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking ROS modulation to downstream cellular effects.
- Provides actionable data for triaging targets based on redox biology relevance.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible assays for ROS, nitric oxide, and glutathione status in mammalian cells.
- Enables quantitative readouts suitable for high-throughput screening and compound evaluation.
- Supports assay platform reuse across diverse cell lines and experimental conditions.
- Establishes robust controls and reference standards for cross-study comparability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns oxidative stress measurements with disease-relevant cellular models in oncology.
- Enables continuity from discovery-stage redox biology to preclinical efficacy and safety studies.
- Supports identification of translational biomarkers linked to ROS modulation.
- Informs risk-adjusted advancement of redox-targeted therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
ROS and nitric oxide detection assays integrate into the discovery-to-preclinical continuum, providing critical readouts for target validation, lead identification, and mechanistic studies in oncology pipelines.
- Discovery Biology: Quantitative ROS and glutathione assays clarify pathway involvement and biological de-risking.
- Screening: Standardized fluorescence, colorimetric, and luminescent assays enable reproducible compound profiling.
- Analytics: Provides robust, quantitative outputs for comparing oxidative stress across experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and continuity from in vitro to in vivo models when disease relevance is established.
- Enterprise Reuse: Assay platforms are adaptable across oncology and immunology research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in redox biology studies.
- Operational Value: Enables standardized, scalable, and reproducible ROS and nitric oxide detection workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by clarifying target relevance in oxidative stress pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of redox-modulating therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence, colorimetric, and luminescent assay techniques.
- Needs access to flow cytometry, plate readers, and luminometers for quantitative analysis.
- Demands rigorous cross-team standardization of assay protocols and controls.
- Assay adaptation may be necessary for different cell types or experimental conditions.
- Rapid signal loss in some assays necessitates precise timing and workflow coordination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Detection of Reactive Oxygen Species Using Carboxy-H2DCFDA
2:34
Measuring of Nitric Oxide (NO) Production Using the Griess Assay
4:42
Detection of ROS Activity by Measuring Oxidized Proteins
5:56
Representative ROS Detection Results
6:49
Conclusion
