تصور انواع معينة ايليجانس استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور بشرة في أناقة البحر الحية الشفافة باستخدام عين صبغة صبغة الفلورسنت الحمراء. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد مجموعة من الديدان الخيطية للتلطيخ. بعد ذلك ، تضاف عين الصبغة المخففة إلى السكان ويسمح لهم بالحضانة.

ثم يتم استرداد من محلول التلوين. يظهر التصوير الفلوري للبشرة الملطخة بداي تفاصيل على السطح ، بما في ذلك الهياكل التناسلية لعين Ailey و Ann والسمات المورفولوجية الخارجية الأخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية لتصور البشرة في هذا الكائن الحي الشفاف مثل التصوير المباشر ، والتألق ، والتعبير الجينات المعدلة ، وتلوين الأجسام المضادة ، والفحص المجهري الإلكتروني ، وجنين القمح المسمى الرص هو أن هذه التقنية سهلة الأداء بسرعة نسبيا وغير مكلفة ، وتنتج دقة جميلة للهياكل الجلدية في الحية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في العديد من المجالات التي تستخدم نظام نموذج أناقة البحر وبشرته ، مثل إفراز الخلايا وتنظيم البشرة ، وتطور خلايا البشرة ، ومسارات الجينات المزمنة غير المتجانسة ، والمناعة الفطرية ، وتطور السمات المورفولوجية وتطور الديدان الخيطية. سيوضح الإجراء روبي شولتز ، طالب دراسات عليا من مختبري. عند العمل مع D Eye ، ضع في اعتبارك أنه حساس للضوء.

قم دائما بحماية عين D من الضوء عن طريق لفها بورق الألمنيوم. ارتد أيضا قفازات ومعطف مختبر لأن DMF سام و DAI سيارة. السيانيد داي قوي جدا.

التخفيف القياسي للقوة هو 30 ميكروغرام لكل مليلتر من DII في M تسعة ، ولا يتطلب سوى عدد سكاني واحد 400 ميكرولتر من تخفيف العمل. ابدأ بصيحة 60 ملم مليئة بالديدان الخيطية غير الملوثة. اغسل من الطبق في 1.5 مل من 0.5٪ تريتون × 100.

في المخزن المؤقت M nine ، قم بتدوير السائل برفق بحركات دائرية لفك جميع اليرقات البالغة ، ثم انقل الغسيل إلى أنبوب سعة 1.5 مل. قم بتدوير على الفور عند 2000 RRP M لمدة 30 ثانية لجمع في الجزء السفلي من الأنبوب. تخلص من أكبر قدر ممكن من المواد الطفية دون إزعاج.

كن حذرا وليس جشعا. اغسل بملليلتر واحد من M تسعة. قم بتدوير وإزالة المادة الطافية.

كرر الغسيل. قم بالدوران مرة أخرى وقم بإزالة المادة الطافية. بعد ذلك عند 400 ميكرولتر من 30 ميكروغرام لكل مليلتر من داي في M تسعة إلى الأنبوب.

دوامة الأنبوب لفترة وجيزة لتعليق. ثم رج الأنبوب عند 20 درجة مئوية في وضع أفقي لمدة ثلاث إلى 16 ساعة عند 350 RP M في بيئة محمية من الضوء. توقيت هذه الخطوات القليلة الماضية مهم.

أولا ، يجب غسل Triton X قبل أن يزيل الدهون التي يربطها الداي. ثانيا ، يجب تلطيخ بمحلول صبغة العين لفترة كافية للسماح بتلطيخ البشرة بشكل موحد. بعد ذلك بقليل ، يجب السماح للحيوانات بالتعافي من الطعام لفترة كافية لإزالة العين غير المقيدة.

في نهاية التلوين ، قم بتدوير وإزالة محلول الصبغة. اغسل بملليلتر واحد من M تسعة. لإزالة الصبغة غير المقيدة ، قم بتدوير وإزالة المادة الطافية.

أعد تعليق في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت M تسعة واسكبها على جزء خال من البكتيريا من صفيحة ميكروية NGM. يسمح المصنف ب OP 50 E Coli للحيوانات بالتعافي في الظلام لمدة 30 دقيقة على الأقل ، ولكن ليس أكثر من يوم لأن مضان الصبغة يتلاشى خلال وقت التعافي. يجب أن تزحف بعيدا عن سائل تلطيخ الصبغة إلى الطعام.

يسهل تصوير هذه لأنها تحتوي على مضان أقل في الخلفية من صبغة العين الحرة. ابدأ بإعداد وسادة زراعية على شريحة لضمان سمك موحد للوسادة الزراعية المستخدمة. فواصل.

يتم عمل فاصل عن طريق وضع قطعتين من شريط المختبر على شريحة زجاجية. يمكن استخدام الفواصل إلى أجل غير مسمى. بعد ذلك ، رتب شريحة زجاجية نظيفة بالطول بين شريحتين فاصلتين ، ماصة حوالي 150 ميكرولتر من أربعة أجار منصهرة.

في وسط الشريحة الزجاجية النظيفة. قم بتغطية AER المنصهر بسرعة بشريحة إضافية موضوعة بشكل عمودي فوق AER وكلا الفواصل لتشكيل وسادة أجار. حرك بعناية من شريحة الغطاء ، مع إبقاء الوسادة في المنتصف في الجزء العلوي من شريحة التثبيت.

الآن ، قم بتركيب خمسة ميكرولترات من مخدر الديدان الخيطية على الوسادة ، وقم بتركيب ثمانية إلى 12 في التخدير وقم بتغطيتها برفق بقلة غطاء المجهر. راقب باستخدام مجهر مركب أو متحد البؤر مزود بهدف 40 × على الأقل ومرشح trissy أو مرشح متوافق آخر. الحد الأقصى للإثارة الفلورية للعين الصبغية هو 549 نانومتر والحد الأقصى للانبعاث 565 نانومتر.

بالنسبة للقالب الملزم ، يعد التصوير هو الجزء الأكثر تحديا في هذا البروتوكول. نوضح كيفية تركيب للتصوير ، لكنك تحتاج إلى التدريب بشكل صحيح على المركب أو النطاق متحد البؤر الذي ستستخدمه. وجدنا أن استخدام هدف بتكبير 60 × على الأقل هو الأفضل لحل التفاصيل المضاءة بطريقة التلوين.

تم التقاط كل صورة من الصور في هذا القسم باستخدام هدف 63 × في أناقة الختم الجنيني للملصق. يحتوي سطح البشرة سنويا مفصولة بأخاديد محيطية وفي بعض المراحل حواف طولية تسمى ailey. تم التقاط كل صورة من الصور في هذا القسم بهدف 63 × في أناقة ما بعد الجنين.

سطح البشرة على حواد سنوية مفصولة بأخاديد محيطية وفي بعض المراحل حواف طولية تسمى aley. تحتوي كل مرحلة من مراحل النمو على هياكل بشرة ذات تركيبات وأنماط مميزة ، وحواف أو أخاديد من كل من صبغة aley و Aly Fluorescently. اعتمادا على تكوين السطح.

في جميع مراحل اليرقات والبالغين باستخدام طريقة الصبغة هذه ، تظل مرئية لمدة تصل إلى يوم بعد الشفاء. في بعض الأحيان ، يتم ملاحظة بقع الفلورسنت في الخلفية ولكن ليس بشكل روتيني. هذه هي بشرة الطافرة البالغة التي تظهر عيوبا معتدلة في تنظيم البشرة.

تلال Ailey متقطعة وزائدة عن العدد. تلال Ailey مدمجة ومتفرعة أو متشعبة ، وهي علامة شائعة معدلة وراثيا. يتسبب الأليل السائد السادس في التواء البشرة ، والذي يمكن رؤيته في الجليل ويمكن أن يتسبب في أن تكون الحلقات غير منتظمة.

Dai أيضا بتلطيخ هياكل البشرة الخارجية الأخرى بما في ذلك الخنثى البالغة والفرج ورفع ذيل الذكور البالغين ويمكن أن يسلط مروحة داي الضوء أيضا على العيوب الدقيقة في التشكل الخارجي مثل هذا الذيل المتشعب ، والتلوين غير الكافي. على سبيل المثال ، يؤدي تلطيخ لمدة ساعتين إلى تلطيخ بشري غير مكتمل ، على الرغم من أن الخلايا العصبية المعرضة للبيئة قد تلطخ بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أربع ساعات ، ولا تشمل التصوير إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تلطيخ أناقة البحر بعين القالب لمراقبة البشرة والهياكل المورفولوجية الخارجية الأخرى.