توجه الخلوي الذاتي الجمعية الى افتعال خواتم نسيج الخلايا المستمدة من النشاط الحيوي لتحليل وهندسة الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء تركيبات أنسجة ثلاثية الأبعاد من الخلايا المجمعة والمصفوفة المشتقة من الخلايا التي يمكن استخدامها للتحليل الوظيفي. يتم تحقيق ذلك عن طريق طحن قالب البولي كربونات أولا لإنشاء آبار حلقية مستديرة القاع. بعد ذلك ، يتم صب بولي ثنائي ميثيل سلون أو PDMS على قالب البولي كربونات لإنشاء قالب.

ثم يتم استخدام قالب PDMS لتشكيل آبار أروس. الخطوة الأخيرة هي زرع الخلايا في آبار القوس للسماح لها بالتجمع وتشكيل حلقات نسيجية متماسكة. في النهاية ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحقيق التجميع الذاتي الخلوي وهندسة الأنسجة باستخدام أنواع مختلفة من الخلايا ، وتمكن من تحليل مساهمة الخلايا والمصفوفة خارج الخلية المشتقة من الخلايا في بنية الأنسجة ووظيفتها.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على مناهج هندسة الأنسجة الأخرى هي أنه يمكننا توليد تركيبات الأنسجة بالكامل من الخلايا والمصفوفة خارج الخلية التي تنتجها بسرعة أكبر مما تم الإبلاغ عنه سابقا ، وبتنسيق يفضي إلى التحليل الميكانيكي ، ابدأ بطحن قطعة من البولي كربونات بسمك نصف بوصة لإنشاء 15 بئرا حلقيا دائريا بقطر مركزي يبلغ ملليمترين. قم بتنظيف قالب البولي كربونات لإزالة أي حطام بلاستيكي ناتج عن عملية الطحن واترك القالب يجف. بعد ذلك ، قم بخلط PDMS بنسبة 10 إلى واحد من عامل المعالجة الأساسي Degas المحلول لإزالة جميع فقاعات الهواء ثم سكبه في قالب البولي كربونات.

ثم قم بإزالة الخليط من القالب مرة أخرى لإزالة أي فقاعات هواء متبقية ومعالجة PDMS في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة أربع ساعات أثناء معالجة PDMS. 2٪ AROS في DMEM بمجرد معالجته ، قم بإزالة قالب PDMS بعناية عن طريق تقشيره ببطء بعيدا عن البولي كربونات ، ثم اغسل PDMS بالماء والصابون وقم بتعقيمه مع محلول DMEM AROS. الآن ضع قالب الأوتوكلاف PDMS على سطح مستو واملأه بالصغار المنصهر عن طريق سحب الماصات أولا في كل قالب من قوالب العمود المركزي ، ثم عن طريق سحب الماصات في الفراغ المحيط بها.

دع الأروس يتصلب لمدة 15 دقيقة. ثم اقلب القالب لتحرير القوس من PDMS. اقطع الفائض من حول كل بئر ، ثم ضع واحدة جيدا في كل بئر من 12 بئر. الآن.

أضف وسائط زراعة الخلايا حول الجزء الخارجي من بئر الحموض دون تغطية الجزء العلوي من البئر. ثم ضع الألواح في الحاضنة للسماح لها بالتوازن أثناء تحضير الخلايا. عند التقاء 90٪ التربسين ، خلايا العضلات الملساء الأبهري للفئران والإعصاء.

الخلايا بتركيز خمسة في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر. ثم قم بعمل ماصة 100 ميكرولتر من معلق الخلية المعلقة في كل من آبار الأروس المتوازنة. باستخدام حركة دائرية لتطبيق الخلايا على كل بئر.

ضع الأطباق في الحاضنة للجلوس دون إزعاج لمدة 24 ساعة. استبدل الوسيط كل يومين عن طريق شفط الوسائط من حول البئر ثم إعادة ملء كل بئر حتى يتم غمر قالب الحروس تماما. وفي ختام الثقافة ، املأ طبق بتري صغيرا ببرنامج تلفزيوني.

قم بإزالة كل حلقة من قالب aros الخاص بها عن طريق تحريكها فوق الجزء العلوي من العمود المركزي. ضع الحلقات في أطباق Petri مع مركز PBS ، وهي حلقة أسفل نظام التصوير الرقمي. استخدم برنامج الكشف عن الحواف لقياس سمك الحلقة في أربعة أوضاع ، أعلى وأسفل ويسار ويمين حول محيطها.

لإجراء اختبار الشد أحادي المحور. قم بتركيب عينة حلقة على مقابض سلكية رفيعة. قم بتمديد المقابض حتى يتم تطبيق حمولة مسيل للدموع خمسة مللي نيوتن على الحلقة.

ثم أدخل مساحة المقطع العرضي المحسوبة من قياسات السماكة وسجل طول المقياس. قم بتدوير الحلقة ثماني مرات بين الحمل المسيل للدموع و 50 كيلو باسكال. الإجهاد بمعدل 10 ملليمترات في الدقيقة بعد الدورة المسبقة الثامنة التي تم سحبها إلى الفشل بسرعة 10 ملليمترات في الدقيقة.

لكل حلقة ، قم بقياس إجهاد الشد النهائي وإجهاد الفشل واحسب معامل الظل الأقصى من البيانات المكتسبة. بالإضافة إلى الدراسات الوظيفية في المختبر ، يمكن أن تندمج حلقات الخلايا الحية هذه أيضا لتشكيل أنابيب الأنسجة. استخدم مقصا جراحيا لقطع نهايات أنابيب السيليكون بزاوية لإنشاء حواف مشطوفة ثم تعقيم أنابيب السيليكون أثناء تعقيم الأنابيب.

املأ طبق بتري بحاملات أنابيب سيليكون مخصصة معقمة لنقل الوسائط إلى خزانة السلامة الحيوية وضعها في طبق بتري فارغ. بعد ذلك ، قم بإزالة الحلقات من آبار أروس وضعها في طبق بتري المليء بالوسائط. ضع أنابيب السيليكون في نفس طبق بتري لترطيبها قبل الاستخدام.

استخدم ملقط لوضع طرف أنبوب سيليكون في وسط الحلقة وحرك الحلقة برفق على أنبوب السيليكون. حرك الحلقات في ملامسة لبعضها البعض عن طريق دفعها برفق على التوالي في كلا الاتجاهين على طول الأنبوب. بمجرد تركيب الحلقات ، قم بمحاذاة أنابيب السيليكون داخل حاملات البولي كربونات وقم بربط جزأين من الحامل معا.

أضف 55 مل من الوسائط إلى طبق بتري. تبادل الوسائط كل ثلاثة أيام لمدة المزرعة لإزالة أنابيب الأنسجة. أولا ، املأ طبق بتري ببرنامج تلفزيوني.

ثم حرر أنابيب السيليكون من حامل البولي كربونات واستخدم الملقط لتحريك أنابيب الأنسجة من أنبوب السيليكون إلى الطبق. عند إجراؤها بشكل صحيح ، تستقر الخلايا في قيعان آبار aros وتتقلص في غضون 24 ساعة بعد الجلوس لتوليد حلقة نسيجية حول العمود المركزي في بئر Agarro ، وهي مخطط تمثيلي لمنحنى إجهاد الإجهاد تم الحصول عليه من اختبار شد أحادي المحور لحلقة نسيجية بحجم ملليمترين تم إنشاؤها من خلايا العضلات الملساء للفئران. ثم يتم استخدام قوة الشد القصوى ومعامل الشد الأقصى وقيم إجهاد الفشل لمقارنة الخواص الميكانيكية لعينات حلقة الأنسجة المزروعة في ظل معايير استزراع مختلفة.

يمكن التحكم في الخصائص الميكانيكية لحلقات الأنسجة عن طريق تغيير معلمات الثقافة ، بما في ذلك عدد جلوس الخلية ، وطول الثقافة ، ووسط الثقافة ، ونوع الخلية المستخدمة. بالإضافة إلى خلايا العضلات الملساء للفئران. تشكل خلايا العضلات الملساء الأولية البشرية حلقات نسيجية ذات قوة شد مماثلة.

تتجمع الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية أيضا لتشكيل حلقات ، لكنها لم تكن قوية بما يكفي للاختبار الميكانيكي. يتيح نظامنا تصنيع تركيبات الأنسجة الهندسية بالكامل من الخلايا ببساطة عن طريق زرع الخلايا في آبار الآروس المخصصة لدينا. بمجرد تشكيل قالب البولي كربونات الأولي ، يمكننا صنع عدد غير محدود من قوالب PDMS التي يمكن استخدامها بعد ذلك لصنع القوالب حتى لا تكون هناك حاجة إلى معدات إضافية.

النظام متعدد الاستخدامات من حيث أننا استخدمنا عددا من أنواع الخلايا المختلفة في النظام لصنع حلقات الأنسجة ، وبالتالي يمكن استخدام هذا النظام بشكل محتمل لكل من تطبيقات هندسة الأنسجة بالإضافة إلى الدراسات المختبرية لمساهمات الخلايا والمصفوفة خارج الخلية في بنية الأنسجة ووظيفتها.