الاستفادة من النانو كريستال Plasmonic والضوئية لتعزيز التلاعب الصغرى ، والجسيمات النانوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو احتجاز أجسام بيولوجية بحجم الميكرون باستخدام ملاقط البلازمونية والبلورات الفوتونية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصنيع الركيزة البلازمونية أو ركيزة البلورات الفوتونية. بعد ذلك، يتم تحضير العينة البيولوجية عن طريق إضافة BSA إلى محلول الخلايا وتوفير مساحة كافية لمحلول الخلايا أسفل شريحة التغطية العلوية.

بعد ذلك، يتم محاذاة الليزر مع المجهر، والذي تم تزويده بمخطط الترشيح المناسب. ثم يتم تركيز المجهر على العينة وإجراء عملية الاحتجاز. وأخيرًا، يمكن احتجاز الجسيمات ذات الحجم الميكروي أو النانوي بكثافة ساقطة منخفضة من خلال الاستعانة بالبنى النانوية البلازمونية أو البلورات الفوتونية.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الملاقط الضوئية التقليدية، في أن تحويل المجالات الضوئية من خلال الهياكل النانوية البلورية الفوتونية والبلازمونية يقلل من الكثافة المطلوبة لاحتجاز الجسيمات الصغيرة مثل الخلايا، كما أنها لا تتطلب حزمة ضوئية ذات تركيز شديد، مما يقلل من خطر التلف الضوئي للخلايا الناتج عن التعرض للإشعاع. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في العديد من المجالات البيولوجية، مثل التفاعل بين الخلايا ودراسة القوى المختلفة في البيولوجيا. كما يمكن أن تكون أداة مفيدة للتصنيع في تكنولوجيا النانو والميكرو من خلال توفير تحكم دقيق في الجسيمات الميكروية والنانوية. ولتكوين مصفوفة من جسيمات الذهب النانوية باستخدام مبخر شعاع الإلكترونات (e-beam evaporator) مع استخدام الكروم كطبقة التصاق، يتم تبخير الذهب على شريحة زجاجية غطاء (cover slip) وصولاً إلى سمك 20 nanometers.

نظف العينة باستخدام بلازما الأكسجين لمدة دقيقة واحدة تقريبًا لإزالة الشوائب العضوية من على السطح. بعد تحفيز الطبقة الأحادية من البوليسترين للتجمع الذاتي، قم بصب السائل على العينة، واتركها في الحاضنة لمدة ساعة واحدة تقريبًا، ثم استخدم كمية كبيرة من الماء لغسل الكرات غير الممتزة واتركها لتجف في الهواء. في النهاية، وبعد تبخر الطبقة الأحادية، يتم ترسيب طبقة ثانية من الذهب بسمك 20 nanometer على كرات اللاتكس في الطبقة الأحادية لتكوين مصفوفة عشوائية من جسيمات الذهب النانوية.

أصبحت مصفوفة الجسيمات النانوية الآن جاهزة للعينة البيولوجية. ضع شريحة الجسيمات النانوية المُحضرة على منصة مجهر فلوري. الخطوة التالية هي تحضير نويات خلايا الفئران للاصطياد البصري.

ابدأ باستخدام أنوية خلايا فئران موسومة بصبغة aine orange لمنع التصاق الأنوية بالركيزة. ضع أنوية الخلايا في قارورة صغيرة وأضف 10%BSA في PBS بتركيز واحد إلى 10 BSA مع الخلط باستخدام جهاز الـ vortex. بعد ذلك، انقل خمسة µL من محلول BSA الخاص بالأنوية إلى الشريحة المجهزة باستخدام الماصة.

لتوفير مسافة فاصلة بين النوى وغطاء الشريحة، ضع مجموعة من غطائين فاصلين حول القطرة، ثم ضع غطاء شريحة آخر فوقهما. وللقنص والتصوير المتزامن، استخدم تكويناً مخصصاً للمجهر الفلوري، يتضمن مرشح إثارة متجاوزاً ومقسمين مخصصين للأشعة ثنائية اللون. يتم بناء الملاقط الضوئية عن طريق إرسال ليزر هيليوم نيون بقدرة 35 milliwatt عبر مجهر zes axio imager D one M، مجهز بمجموعة مرشحات GFP 17، والتي تم تعديلها للسماح لإشعاع الليزر بطول موجي 633 nanometer بالوصول إلى العينة.

سيعمل المجهر على تركيز شعاع الليزر على العينة، ومن ثم سيتحرف الشعاع إما بواسطة ركيزة الجسيمات النانوية البلازمونية أو بواسطة محزز الحيود. ولتصوير نويات الخلايا، التي يبلغ قطرها حوالي خمس ميكرونات، استخدم عدسة Zeiss LDEC epi plan مع عدسة شيئية Neola 50 x. ابدأ بوضع العينة على العدسة الشيئية والتركيز على المستوى الذي يحتوي على أكبر عدد من النويات، حيث تكون مستقرة على سطح الركيزة.

بعد ذلك، قم بتركيز المجهر على نواة يراد اصطيادها من خلال البحث عن نوى خلوية طافرة بحرية فوق طبقات الخلايا الموجودة على السطح. ثم ضع بقعة مصيدة الليزر فوق الجسيم. في هذه المرحلة، يجب أن يتم اصطياد الجسيم ويحافظ على موضعه ضمن بقعة الليزر حتى عند تحريك المنصة.

من المرجح أن تنجرف نوى الفئران الموجودة في المستوى البؤري للمجهر مع تيار ميكروفلويديك طفيف ناتج عن تسخين العينة وتبخرها، بينما ستظل النوى الموجودة في المصيدة في موضع واحد. يوضح هذا الشكل صورة مجهرية إلكترونية ماسحة لجسيمات ذهبية نانوية ذاتية التجميع، يبلغ قطر كل منها حوالي 450 nanometers. وهذه صورة مجهرية بصرية ماسحة للمجال القريب للركيزة البلازمونية حيث يكون توزيع الجسيمات النانوية متفرقاً، مما يوضح إشعاع المجال القريب.

يبلغ الطول الموجي لليزر الإثارة 633 نانومتر، ويظهر هنا طيف كفاءة التشتت للركيزة البلازمونية حيث تظهر الذروة عند 624 نانومتر. كما يظهر طيف كفاءة الامتصاص للركيزة البلازمونية ذروة عند 668 نانومتر. جسيمات ذهبية نانوية كروية موزعة عشوائيًا على نطاق ثنائي الأبعاد بمساحة مربع واحد في واحد.

تظهر الميكرومترات هنا. تمثل كل دائرة زرقاء مركز الكرة النانوية. وتظهر في هذه اللوحات توزيعات مجال التشتت على مستويات المراقبة، والتي تكون موازية لمصفوفة الكرات النانوية العشوائية.

توضح هذه المخططات الحد الأدنى من شدة الليزر اللازمة للحفاظ على المصيدة كدالة في معدل تدفق السائل المحيط. وباستخدام الاحتجاز البلازموني، تم قياس جميع الشدات الضوئية عند مستوى العينة تحت عدسة المجهر الشيئية. ويعرض كل لوح نتائج القياس لخرزات بوليستيرين مفردة بأقطار مختلفة.

توضح الصور المدرجة الصور المجهرية المقابلة للجسيمات. تمثل أشرطة المقياس في جميع الصور طول خمسة ميكرومترات. المخطط هنا يوضح ميل الخط المجهز المار بنقطة الأصل في المخططات السابقة مقابل حجم الجسيمات.

للمصيدة البلازمونية. توضح أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية للملاءمات الخطية. وتظهر النتائج أن الجسيمات الأكبر تتطلب شدة ليزر أعلى للحفاظ على استقرار كافٍ للمصيدة.

يوضح هذا المخطط تعزيز الاصطياد البصري باستخدام هياكل نانوية دورية أحادية البعد (1D). يتم حيود الشعاع الساقط بواسطة الهيكل النانوي الدوري في المجال البعيد. ويظهر هنا توزيع كثافة الضوء باستقطابين متعامدين على سطح تدرج من الألمنيوم.

باستخدام دورة قدرها 417 nanometer تم الحصول عليها من خلال محاكاة المجال الزمني للفروق المحدودة، يتم تطبيع التوزيع وفقاً للشدة على سطح ألومنيوم مسطح. توضح هذه الأشكال جهد الاحتجاز للجزيئات الموجودة مباشرة فوق السطح المتدرج مقابل موقع الجزيء. بالنسبة لخرزة البوليسترين CA بحجم 350 nanometer وخرزة البوليسترين DA بحجم 1 µm، توضح الدوائر البيضاء أحجام الجزيئات.

توضح الصور المدرجة جهد الاحتجاز فوق سطح ألومنيوم مسطح. وذلك لنفس حجم الجسيمات لأغراض المقارنة. وقد تم توحيد القيم لكل حجم جسيمات.

بالنسبة لجميع أشكال محاكاة FDTD، يبلغ مجال الرؤية 10 في 8 ميكرومتر مربع. يوضح الشكل التالي كفاءة المصيدة والشدة الدنيا للاحتجاز المقاسة لخرزات البوليسترين بمقاسات مختلفة، مع استقطاب الحزمة بشكل عمودي على خطوط التدرج. ويوضح الشكل الداخلي عدم التماثل في كفاءة الاحتجاز عند تحريك خرزة بوليسترين بحجم 3.87 ميكرومتر، بشكل عمودي وموازٍ لقواعد التدرج.

إليك تمثيل تخطيطي لزاوية الإزاحة للجسيم. يوضح هذا الشكل المدرج التعزيز مقابل اتجاه الإزاحة لاستقطابات وأحجام جسيمات مختلفة. يتم الحصول على عدم التماثل الكبير الممثل بالخط المتصل عند استخدام ضوء ساقط مستقطب عمودياً على التدرج، بينما يمثل الخط المقطع.

يتم الحصول على تباين صغير باستخدام ضوء ساقط مستقطب بالتوازي مع التدرج. تمثل هذه اللوحات عرضاً لعملية احتجاز حبيبة بوليسترين فلورية بحجم 590 nanometer. تشير الدائرة الحمراء إلى موضع بقعة الليزر حيث كان ضوء الليزر خافتاً جداً بحيث لم يكن مرئياً في البداية.

يتم احتجاز الجسيم داخل البقعة عند القدرة العالية. ومع خفض القدرة، تتغلب الحركة البراونية للجسيم على قوة الاحتجاز، مما يسمح للجسيم بالهروب. هنا، تم احتجاز نواة خلية سرطان مبيض فلورية، وكانت أدنى شدة مطلوبة لبدء الاحتجاز هي 16 micro watts per micrometer squared تم الحصول عليها باستخدام عدسة شيئية 20 x.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مصيدة بصرية منخفضة الشدة للتلاعب غير الغازي بالعينات البيولوجية ذات الأحجام الميكرونية والنانوية باستخدام ركائز نانوية ذات بنية بلازمونية وبلورية فوتونية.