الخلوية لاستخراج الدهن المستهدفة التخفيف النظائر المستقرة تحليل السائل الطيف اللوني القداس

تهدف الطريقة إلى تحديد المستقلبات الدهنية الخلوية النشطة بيولوجيا بدقة من خلال الجمع بين تخفيف النظائر المستقرة ، ومرحلة cnor ، والكروماتوغرافيا السائلة ، والتقاط الإلكترون ، والضغط الجوي ، والتأين الكيميائي ، وقياس الطيف الكتلي. ابدأ بحصاد عينات الوسائط والخلايا وأضف نظيرا ثقيلا يسمى مزيجا قياسيا داخليا. استخرج الدهون النشطة بيولوجيا باستخدام المذيبات العضوية ، ثم اشتقاق الدهون النشطة بيولوجيا باستخدام كاشف التقاط الإلكترون ، واستمر في تحديد الدهون النشطة بيولوجيا بدقة عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة.

يحدد قياس الطيف الكتلي من خلال تحليل LCMS لكل من محللة الخلايا ونتائج الوسائط بدقة تركيز الدهون النشطة بيولوجيا المستهدفة ومستويات Anant ERs الفردية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الكروماتوغرافيا السائلة ذات الطور العكسي ، وقياس الطيف الكتلي ، وطرق LCMS الأخرى ، هي أن الفرد وقرن النون يتم قياسه بدقة من خلال استخدام كروماتوغرافيا الطور العادي للسيارة وتخفيف النظائر المستقرة. يمكن أن توفر البيانات الناتجة نظرة ثاقبة للمسارات الأنزيمية التي تعمل في الخلية.

لكل صفيحة 10 سم من مادة لاصقة ، تجمع الخلايا ثلاثة ملليلتر من الوسائط في أنبوب طرد مركزي زجاجي سعة 10 مل. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. ثم أضف ملليلتر واحد من PBS ، واكشط الخلايا من اللوحة ، وانقل العينة إلى ثانية إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي سعة 10 ملليلتر.

قم بإعداد ثمانية أنابيب إضافية بثلاثة ملليلتر من PBS لمنحنى المعايرة. ثم أضف 10 ميكرولتر من معيار المعايرة المناسب لكل أنبوب. محاذاة كل عينة اختبار من ثلاثة ملليلتر جمعت الوسائط زراعة الخلايا لاستخراج الدهون النشطة بيولوجيا الحرة.

أضف 10 ميكرولترات من المزيج القياسي الداخلي إلى كل معيار معايرة وقم بتوازن العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لمعالجة العينات بمقدار خمسة ملليلتر من داثيل إيثر وضعها على شاكر لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي للعينات ونقل المرحلة العضوية العلوية إلى أنابيب طرد مركزي زجاجية سعة 10 مل. استمر في تجفيف العينات تحت النيتروجين أولا ، اجمع عينات الخلايا المحصودة عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق كل منصة نقالة في ملليلترين من PBS بواسطة Vortex Reserve 25 ميكرولتر من كل عينة لتطبيع محللة الخلية.

الآن قسم كل محللة بالتساوي إلى أنابيب طرد مركزي زجاجية سعة 10 مل. أضف ملليلترين إضافيين من PBS و 10 ميكرولتر من ISM إلى كل عينة من أجل قياس الدهون الخلوية الحرة وتجنب التحلل القلوي للدهون مثل البروستاجلاندين ، استخدم واحدة من كل عينة مكررة لإجراء عمليات استخراج الأثير داثيل كما هو موضح سابقا. لاستخراج الدهون الأستيرية ، أضف خمسة ملليلتر من خليط الميثانول الكلوروفورم إلى كل عينة من العينات المتبقية.

ضعه على شاكر بسرعة منخفضة لمدة 30 دقيقة ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق. الآن ، اجمع الطبقة العضوية السفلية وجفف العينات تحت النيتروجين لتغذية الدهون الأستيرية. أضف 0.5 مل من 0.4 هيدروكسيد البوتاسيوم العادي في 80٪ ميثانول إلى كل أنبوب.

احتضان العينات عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم أضف ملليلترين من PBS واضبط الرقم الهيدروجيني اثنين ستة بحمض الهيدروكلوريك المركز. أخيرا ، أضف 10 ميكرولترات من ISM إلى كل عينة وانتقل إلى استخراج الأثير داثيل إلى العينات المجففة ومعايير المعايرة.

أضف كواشف الاشتقاق بالترتيب المحدد. ثم قم بدوامة العينات واحتضانها عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. الآن ، جفف العينات تحت النيتروجين قبل التخزين والتحليل.

تستخدم هذه الطريقة مزيجا من تخفيف النظائر المستقرة ، وتشي ، والكروماتوغرافيا السائلة ، والتقاط الإلكترون ، والضغط الجوي ، والتأين الكيميائي ، وتحليل الطيف الكتلي. أعد تشكيل العينات ومعايير المعايرة في 100 ميكرولتر من الإيثانول الهكساني ، وانقل العينات بأكملها إلى قوارير HPLC مع إدخال العينات في جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكية المبردة. قم بإنشاء قائمة نموذجية للتحليل.

بعد ذلك ، قم بإعداد طرق HPLC و MS باستخدام المعلمات الموضحة في الجدول الأول والجدول الثاني في البروتوكول المكتوب المصاحب لفصل الطور العادي. حزمة لولبية ، عمود DH إلى 30 درجة مئوية ، حقن العينة وبدء التشغيل. الآن قم بتعيين MS في وضع الأيونات السالبة باستخدام مصدر A PCI.

ابدأ بفارغة هكسان لتحقيق التوازن في العمود. بعد ذلك ، قم بتشغيل عينات المعايرة القياسية من أجل زيادة تركيز SM. استمر في معالجة عينات اختبار وسائط الاستزراع بعد فصل HBLC.

أضف عمود عمود الميثانول لتجنب الترسب على إبرة الهالة. استخدام البيانات التي تم إنشاؤها من المعايير. قم بإنشاء منحنى معايرة يرسم مساحة العينة على المحور Y ، ويستمد التركيز القياسي على المحور x معادلة Y يساوي MX زائد B.

أخيرا ، حدد تركيزات عينة الاختبار للدهون النشطة بيولوجيا للخلية. الليزات. قم بتطبيع هذه القيم بقسمة التركيز المحدد للدهون النشطة بيولوجيا على عدد الخلايا لكل صفيحة أو إجمالي البروتين الذي تم تطبيعه في الخطوات السابقة. تشير البيانات من مراقبة التفاعل المتعدد إلى العديد من حمض اللينوليك والأراكيدونيك.

المستقلبات المؤكسدة. 13 وتسعة ، تمسك جنبا إلى جنب مع 13 وتسعة أوكسو المقابلة مشتقة من حمض اللينوليك. بالإضافة إلى ذلك ، توجد أيضا مستقلبات حمض الأراكيدونيك الحرارية ومنتجاتها المؤكسدة كما هو متوقع.

هناك تحول بسيط في وقت الاحتفاظ بالمعيار الداخلي المخفض مقارنة بالمعيار غير المسمى. الأهم من ذلك ، أن هذا البروتوكول يفصل أيضا الحرارة والقرون الرومية ويحدد التحولات الفريدة لأيزومرات الاستريو التي يمكن أن تنتج عن الأكسدة الأنزيمية لحمض الأراكيدونيك أو من التفاعل مع أنواع الأكسجين التفاعلية. على سبيل المثال ، يوضح هذا الرسم الكروماتوغرامي الفصل بين أيزومرات الاستريو r و s لخمسة.

التحليل الشحمي الحراري هو تقنية قوية لتحليل العديد من أنواع الدهون. على سبيل المثال ، تقوم هذه التجربة بتقييم وقياس البروستاجلاندين ، و isop senes ، و leukotriene B four. بالإضافة إلى الحرارة التي يأكلها أوكسو ومستقلبات أوميغا هيدروكسيل ، يمكن تحسين هذه الطريقة لاستخراج الدهون النشطة بيولوجيا من المصفوفات البيولوجية الأخرى مثل البلازما والبول والأنسجة.

في بعض الحالات ، تم استخدام الدهون النشطة بيولوجيا كمؤشرات حيوية للاستجابة للإجهاد التأكسدي.